拉曼現(xiàn)象由印度科學(xué)家C.V. 拉曼于1920 年代發(fā)現(xiàn)1, 2瞻鹏。如今，拉曼光譜已成為廣泛使用的探知分子振動模式的方法3鹿寨，4新博。與其他分析化學(xué)方法相比，光譜方法可以提供很高的空間分辨率脚草，探測裝置無需與樣品相接觸赫悄。分子振動光譜提供了相對較高的化學(xué)特異性，且不需要額外的標(biāo)記馏慨。然而埂淮，自發(fā)拉曼現(xiàn)象是一個(gè)非常弱的散射現(xiàn)象。如果直接使用自發(fā)拉曼進(jìn)行成像或者顯微研究写隶，一張圖可能需要幾小時(shí)的采集時(shí)間倔撞。因此，相干拉曼方法慕趴，如受激拉曼散射如今被廣泛的應(yīng)用于顯微鏡研究痪蝇。在這個(gè)應(yīng)用指南中鄙陡，我們將講述如何使用Moku:Lab的鎖相放大器進(jìn)行受激拉曼散射的信號探測。
受激拉曼散射顯微鏡
Moku:Lab 鎖相放大器的使用
拉曼現(xiàn)象由印度科學(xué)家C.V. 拉曼于1920 年代發(fā)現(xiàn)1, 2躏啰。如今趁矾，拉曼光譜已成為廣泛使用的探知分子振動模式的方法3，4给僵。與其他分析化學(xué)方法相比毫捣，光譜方法可以提供很高的空間分辨率，探測裝置無需與樣品相接觸帝际。分子振動光譜提供了相對較高的化學(xué)特異性蔓同，且不需要額外的標(biāo)記。然而蹲诀，自發(fā)拉曼現(xiàn)象是一個(gè)非常弱的散射現(xiàn)象牌柄。如果直接使用自發(fā)拉曼進(jìn)行成像或者顯微研究，一張圖可能需要幾小時(shí)的采集時(shí)間侧甫。因此珊佣，相干拉曼方法，如受激拉曼散射如今被廣泛的應(yīng)用于顯微鏡研究披粟。在這個(gè)應(yīng)用指南中咒锻，我們將講述如何使用Moku:Lab的鎖相放大器進(jìn)行受激拉曼散射的信號探測。
背景介紹
拉曼光譜是一種非破壞性的分析化學(xué)方法守屉。它可以用來直接探測分子的振動模式惑艇。相比于基于電子能級的光譜光譜方法，拉曼光譜顯著提高了測量的特異性拇泛，而且不需要在系統(tǒng)中引入熒光標(biāo)記滨巴。被測樣品能夠以完全無接觸，無標(biāo)記的方法進(jìn)行檢測俺叭，防止了其他因素對系統(tǒng)的影響6恭取，7。紅外光譜是另一種常見的分子振動光譜方法熄守。紅外與拉曼光譜有著不同的選擇定則蜈垮。紅外光譜對偶極子的變化敏感，而拉面光譜則對極化率敏感4裕照。這使得紅外與拉曼對特定的化學(xué)鍵振動有著更好的探測效果攒发。對于成像應(yīng)用，還有兩個(gè)其他的考慮因素：1）紅外有著較長的波長晋南，通常達(dá)到幾個(gè)微米惠猿。這使得成像的空間分辨率被其波長本身所限制。拉曼可以使用可見或近紅外光源负间，所以可以達(dá)到更高的高的空間分辨率偶妖。2）水分子對紅外有著很強(qiáng)的吸收姜凄。在水分較為豐富的環(huán)境中，比如生物樣品餐屎，紅外光譜可能會受到較強(qiáng)背景吸收的影響檀葛。因此玩祟，拉曼光譜在這些情況下通常有著更廣泛的應(yīng)用腹缩。
拉曼散射相對于瑞利散射，是一個(gè)較弱的散射現(xiàn)象空扎。通常藏鹊，一個(gè)光譜測量需要進(jìn)行幾秒鐘的信號平均以獲得足夠的信噪比。對于光譜測量转锈，這本身不是一個(gè)問題盘寡。然而，對于光譜成像而言撮慨，這意味著一張圖可能需要幾個(gè)小時(shí)的信號平均竿痰，嚴(yán)重限制了高通量樣品檢測的能力。因此砌溺，多種不同的方法相繼被用來提高拉曼信號的強(qiáng)度影涉。比如使表面增強(qiáng)拉曼可以使得拉曼光譜的探測極限到達(dá)單分子層級8。然而规伐，這些測量所引入的納米顆粒很難均勻的分布到樣品中蟹倾，因此難以做到定量分析。對于成像科學(xué)來說猖闪，非線性光學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的增強(qiáng)效果是一個(gè)更加適合的方法鲜棠。比如受激拉曼散射（SRS）效應(yīng)，以及相干反斯托克拉曼散射（CARS）效應(yīng)培慌。
圖1：自發(fā)拉曼豁陆，SRS以及CARS的雅布隆斯基圖
相干拉曼效應(yīng)Z早于1960年代被發(fā)現(xiàn)6。在90年代晚期和00年代吵护，隨著超快鎖模激光的發(fā)展献联，謝曉亮以及其同事相繼發(fā)表了有關(guān)CARS9和SRS10的無標(biāo)記化學(xué)信息顯微鏡論文。此后何址，這些技術(shù)被廣泛應(yīng)用到有關(guān)化學(xué)里逆，生物學(xué)以及材料學(xué)的研究當(dāng)中6，7用爪，11原押。CARS和SRS有著諸多相似性：這些非線性光學(xué)過程通常會發(fā)生在同樣的條件下，且實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)置大致相同偎血。當(dāng)然诸衔，也有一些不同點(diǎn)：比如CARS的信號（圖1盯漂，ωas）與自發(fā)拉曼相似，發(fā)生在與輸入光源（ωp, pump, ωs Stokes）不同的波長笨农。因此就缆，通過短通濾波片可以輕易將信號分離。信號本身光強(qiáng)較弱谒亦，所以一般使用比較敏感的探測器竭宰，比如光電倍增管（PMT）進(jìn)行探測。然而份招，CARS的探測同時(shí)會受到一些其他非共振非線性光學(xué)現(xiàn)象產(chǎn)生的背景切揭。這些背景限制了實(shí)際使用這種CARS的檢測極限，并同時(shí)使所測得的光譜與自發(fā)拉曼相比產(chǎn)生一定畸變锁摔。另一方面廓旬，SRS信號不受到大多數(shù)其他非線性光學(xué)現(xiàn)象的影響。然而谐腰，SRS的信號本身發(fā)生在與輸入光源相同的波長孕豹。SRS現(xiàn)象本身只相應(yīng)的稍微減弱或增加泵光或者斯托克斯光源。這些相應(yīng)較小的變化很難用常規(guī)方法進(jìn)行探測十气，因此励背，需要使用泵浦-探測以及鎖相法進(jìn)行探測。
光學(xué)泵浦-探測以及鎖相探測
泵浦-探測是多光子探測中常用的方法桦踊。這些試驗(yàn)通常使用兩束超快激光椅野。一束激光時(shí)刻對樣品進(jìn)行照射，另一束激光則通過調(diào)幅調(diào)制在一個(gè)固定的頻率籍胯。因此竟闪，如何由第二束光作用與D1束光所產(chǎn)生的變化都會被傳遞到D1束光中。在檢測段杖狼，將調(diào)制的光束使用空間炼蛤，或者濾波片的方法阻擋。只有本身未調(diào)制的光能到達(dá)探測器蝶涩。因?yàn)樾盘柋旧碇话l(fā)生在調(diào)制頻率理朋，因此，只要使用鎖相放大器對調(diào)制頻率進(jìn)行檢測绿聘，就能檢測出兩束光互相作用所產(chǎn)生的信號嗽上。鎖相放大器使用混頻原理，可將輸入的電子信號與本地振蕩信號混頻熄攘，并通過低通濾波器濾除并放大兽愤。在頻譜中，只有十分接近本地振蕩器頻率的信號才能被放大并檢測。而其他頻率的光浅萧，比如激光本身的重復(fù)頻率逐沙，以及DC背景都會被濾掉。這使得鎖相放大器成為泵浦-探測不可或缺的儀器洼畅。有關(guān)鎖相放大器更詳細(xì)的介紹吩案，可以參考以下文章：鎖相放大器的基本原理
對于SRS的檢測，我們將兩束激光的能量差精確的調(diào)節(jié)到我們想要檢測拉曼位移的能量級帝簇。然后徘郭，我們可以對泵浦光，或者斯托克斯光進(jìn)行調(diào)制己儒。如果泵浦光被調(diào)制崎岂，則SRS會對斯托克斯光在調(diào)制頻率產(chǎn)生一個(gè)微弱的增強(qiáng)捆毫。如果我們在檢測端檢測斯托克斯光闪湾，則所測得的增強(qiáng)被稱作受激拉曼增強(qiáng)（SRG）。相反绩卤，如果我們對斯托克斯光進(jìn)行調(diào)制途样，則SRS會對泵浦光在調(diào)制頻率產(chǎn)生一個(gè)微小的減弱。如果我們在檢測端對泵浦進(jìn)行檢測濒憋，則所測得的增強(qiáng)被稱為受激拉曼減弱（SRL）何暇。由于我們所使用的檢測器在泵浦光有著更好的檢測效率，在這個(gè)應(yīng)用指南中我們將使用SRL檢測方法凛驮。
圖2：SRS顯微鏡的SRL和SRG檢測
試驗(yàn)設(shè)置
激光
SRS的產(chǎn)生需要兩束超快激光同時(shí)在時(shí)間和空間上相互交疊裆站。為了獲得穩(wěn)定的時(shí)間同步，大部分SRS顯微鏡通常使用一個(gè)Ti:Sapphire激光產(chǎn)生泵浦和斯托克斯光源黔夭。皮秒與飛秒激光都可以用來進(jìn)行SRS的產(chǎn)生宏胯。皮秒激光本身擁有更精細(xì)的光譜。使用皮秒激光可以利用簡單的光學(xué)設(shè)置達(dá)到更高分辨率的光譜本姥。與自發(fā)拉曼不同肩袍，SRS一次檢測只能測得單色的光譜信息。因此婚惫，檢測更多的拉曼位移需要調(diào)節(jié)激光本身的波長氛赐。這個(gè)過程通常限制了光譜的掃描速度。另一方面先舷，飛秒激光可以使用光譜對焦的方法快速的調(diào)節(jié)泵浦光與斯托克斯之間的能量差艰管，光譜圖像可以在更快的被采集。然而蒋川，這個(gè)方法顯著提高了光路的復(fù)雜度牲芋。高折射率的材料，比如SF57玻璃柱，或者一對光柵需要被加入到光路中街图。同時(shí)浇衬，光譜掃描的范圍本身也有限。一個(gè)關(guān)于光譜對焦的詳細(xì)介紹可以在一篇Z近發(fā)表的文獻(xiàn)中查詢12餐济。
總結(jié)來說耘擂，如果成像只需要測量單個(gè)拉曼位移，則皮秒激光可以簡化光路的設(shè)置絮姆。對于光譜圖像的采集醉冤，飛秒激光可以極大的提高采集速度。Moku:Lab的鎖相放大器可以與皮秒或者飛秒激光所配合使用篙悯。在這個(gè)應(yīng)用指南中蚁阳，我們將使用飛秒激光（Spectra-physics Mai Tai）配合SF57玻璃柱對光譜對焦SRS進(jìn)行演示湿故。
調(diào)制昂芜，延時(shí)臺，以及掃描鏡
泵浦光和斯托克斯光通常會使用電光調(diào)制器（EOM）或聲光調(diào)制器（AOM）進(jìn)行調(diào)制逮矛。調(diào)制頻率通常在兆赫茲的頻段矮燎。這樣可以有效的降低光熱效應(yīng)定血，提高圖像采集的速度。在這個(gè)應(yīng)用指南中诞外，我們將使用AOM對泵浦光在2兆赫的頻率進(jìn)行調(diào)制澜沟。
在光路中，一個(gè)電動延時(shí)臺被用來準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)泵浦和斯托克斯光之間的延時(shí)峡谊。對于光譜對焦的SRS來說茫虽，這個(gè)延時(shí)臺同時(shí)被用來微調(diào)兩束光之間的能量差。像大多數(shù)非線性光學(xué)成像系統(tǒng)一樣既们，SRS和CARS的成像大多使用的是光束掃描的方法濒析。一堆振鏡被放置在物鏡前對光線進(jìn)行掃描。在這個(gè)展示中贤壁，我們使用了一對Thorlabs的GVS 102振鏡悼枢。
物鏡，聚光鏡脾拆，探測器馒索，數(shù)據(jù)采集
當(dāng)激光經(jīng)過振鏡掃描后，通過物鏡在樣品上形成一個(gè)焦點(diǎn)名船。相干拉曼成像通常使用高NA的水鏡或者油鏡進(jìn)行測量绰上，從而更有效地達(dá)到相位匹配的條件。通過樣品后渠驼，光在前進(jìn)方向被采集蜈块，并重新聚焦在探測器上。通常，我們使用浸油聚光鏡來提高采集效率百揭。在這個(gè)示例中爽哎，我們使用了1.2NA，60倍（UPLSASP 60XW器一， 奧林巴斯）的物鏡對光進(jìn)行了聚焦课锌。
光被聚光鏡采集后，通過了一個(gè)光學(xué)濾鏡阻斷被調(diào)制的光后祈秕，被重新聚焦到了光電二極管上渺贤。二極管所產(chǎn)生的信號隨后被送入鎖相放大器。取決于光電二極管的結(jié)構(gòu)请毛，電流或電壓前置放大器可以被放置于二極管和鎖相放大器之間志鞍。鎖相放大器隨后將收集的信號與本地振蕩器混頻，將調(diào)制的AC信號轉(zhuǎn)換成DC信號方仿，放大并輸出固棚。信號隨后被送入采集卡中成圖并儲存。在這個(gè)應(yīng)用指南中兼丰，一個(gè)Hamamatsu S3994-01光電二極管玻孟，配合一個(gè)自制的電流電壓轉(zhuǎn)換器被用來檢測光學(xué)濾鏡后所剩余的信號唆缴。這個(gè)信號被Moku:Lab的鎖相放大器以外部參考（PLL）模式鳍征，7微秒二階的時(shí)間常數(shù)進(jìn)行解調(diào)。解調(diào)后面徽，這個(gè)信號被加以一個(gè)10 dB的增益艳丛，Z后送到了NI DAQ系統(tǒng)對信號，配合NI的虛擬儀器進(jìn)行Z后的處理合成圖趟紊。
圖3：SRS顯微鏡以及Moku:Lab的使用
結(jié)果與討論
我們使用SRS顯微鏡對一個(gè)二甲基亞砜（DMSO）的液滴進(jìn)行了檢測氮双，并挑選了液滴的邊緣作為成像區(qū)域。激光與振鏡前被調(diào)節(jié)成了798 nm的泵光（30 mW）以及1040 nm的斯托克斯光（150 mW）霎匈。通過改變延時(shí)臺戴差，我們在可調(diào)光譜范圍內(nèi)采集了100張圖像。圖4中展示了這個(gè)液滴邊緣的x-y（左側(cè)）以及z（右側(cè)）方向的信息铛嘱。在光譜中暖释，我們可以觀察到C-H鍵在此區(qū)間產(chǎn)生的兩個(gè)共振峰。
圖4：二甲基亞砜液滴的SRS圖像
我們通過使用Z亮的圖像切層（約在2930 cm-1）來計(jì)算圖片的信噪比墨吓。我們選取了信號區(qū)域與背景區(qū)域球匕，10X10的區(qū)域，并使用信號區(qū)的平均值除以背景區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)差定義為信噪比帖烘，Z終算出了大約為1100的信噪比亮曹。
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