熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)是一種鑒別熒光團(tuán)獨(dú)特分子環(huán)境的有力技術(shù)。FLIM測量熒光團(tuán)在發(fā)射光子之前處于激發(fā)態(tài)的時間吼旧，并檢測熒光團(tuán)的分子變化凰锡，這些變化單獨(dú)用光譜技術(shù)是看不出來的。FLIM對多種生物醫(yī)學(xué)過程敏感，包括疾病進(jìn)展和藥物療效寡夹。
熒光的產(chǎn)生與熒光壽命檢測原理
當(dāng)處于基態(tài)的分子(圖1中的S0表示)吸收的光能量等于或大于較高能級的光(S1;S2;:::;Sn)处面，電子在短時間內(nèi)被激發(fā)到更高的能級厂置。電子將經(jīng)歷振動弛豫到激發(fā)態(tài)的最低振動水平(記為S1)菩掏，這是一種稱為內(nèi)轉(zhuǎn)換的非輻射過程。從S1電子態(tài)昵济，分子通過輻射或非輻射過程回到基態(tài)智绸。圖1表示了在這些能級中發(fā)生的不同發(fā)光現(xiàn)象。
熒光是分子(熒光團(tuán))通過發(fā)射可檢測的光子(時間尺度為
)衰減到基態(tài)的輻射過程访忿。熒光發(fā)射發(fā)生在激發(fā)電子能級最低的位置(S1)瞧栗。這種來自最低激發(fā)電子能級的強(qiáng)制發(fā)射確保了發(fā)射光譜保持不變，并且與激發(fā)波長無關(guān)海铆。由于振動弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換中的能量損失迹恐，發(fā)射的熒光光子的能量較低(即發(fā)射發(fā)生在比激發(fā)更長的波長)。這種發(fā)射波長的位移稱為斯托克斯位移卧斟。另一個主要發(fā)光過程殴边，磷光，通過被稱為系統(tǒng)間交叉(ISC)的過程發(fā)生在激發(fā)時電子能量躍遷到三元態(tài)能級(T1;T2;:::;Tn)珍语。三重態(tài)的電子具有平行自旋锤岸，這些電子躍遷是“自旋禁止的”，通過發(fā)射一個磷光光子或ISC反轉(zhuǎn)和發(fā)射一個延遲的熒光光子板乙，導(dǎo)致向地能級的緩慢躍遷是偷。磷光的發(fā)生時間從毫秒到數(shù)百秒不等。圖1所示的Jablonski圖簡潔地說明了這些過程募逞。
圖1
分子的量子產(chǎn)率被定義為發(fā)射的光子與吸收的光子之比蛋铆。常見熒光化合物的量子產(chǎn)率包括熒光素的80%，eGFP的60%放接，色氨酸的6%刺啦，還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的2%。分子的這種發(fā)射效率取決于(1)它相對于入射電磁波電場方向的空間方向(極化)透乾，(2)吸收入射光子能量可用的電子能級(吸收光譜)洪燥，(3)振動能級重排的效率(熒光壽命)，(4)弛張回到基態(tài)電子能級(斯托克斯位移)乳乌，(5)基態(tài)(發(fā)射光譜)內(nèi)振動能級的總體捧韵。熒光團(tuán)由吸收光譜、熒光壽命汉操、斯托克斯位移和發(fā)射光譜表征再来。
按照慣例，熒光壽命τ定義為熒光團(tuán)處于激發(fā)態(tài)的平均時間。在此區(qū)間內(nèi)芒篷，強(qiáng)度I（t）減小到1/e或其原始值的36.8%搜变。t時刻的衰變強(qiáng)度由樣本中所有物種i的一級動力學(xué)方程求和得到。
其中α是指前因子或指數(shù)函數(shù)的幅值针炉。多指數(shù)混合種的平均壽命(τm)是各種壽命(τi)與各種貢獻(xiàn)(αi)的加權(quán)之和挠他。
另外，在t時刻被激發(fā)的分子數(shù)為
其中n（t）是t時刻處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)篡帕。
在熒光壽命的檢測中殖侵，樣品由一個短的激勵脈沖激發(fā)，衰減由光子到達(dá)時間計算镰烧，光子被分組成直方圖拢军，或通過時間門控檢測或脈沖采樣技術(shù)。如果有多個熒光種存在怔鳖，所有的種都被總結(jié)為一個單一的直方圖茉唉。在頻域方法中，每個光子都用它相對于激發(fā)光子的相位延遲來表示结执，這類似于到達(dá)時間直方圖度陆。對于多物種，在傅里葉空間中分析這種相位分布昌犹，提取分離多物種的調(diào)制解調(diào)參數(shù)坚芜。時域和頻域都在不同的FLIM場景中提供了獨(dú)特的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，包括低光子預(yù)算成像斜姥，高動態(tài)范圍成像鸿竖，或高時間分辨率成像。
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