長(zhǎng)期以來(lái)江兢，光學(xué)顯微鏡的分辨率都被認(rèn)為是有極限的翠订，它不可能超過(guò)二分之一個(gè)光波長(zhǎng)度。熒光顯微成像是一類(lèi)對(duì)特定樣本使用熒光蛋白或分子標(biāo)記后對(duì)其標(biāo)記物成像的光學(xué)顯微成像技術(shù)程帕。而超分辨率熒光顯微成像系統(tǒng)由于其可以實(shí)現(xiàn)納米級(jí)的成像分辨率该默，且對(duì)樣品破壞性小瞳氓，可進(jìn)行三維成像，可進(jìn)行活體樣品觀測(cè)等特點(diǎn)栓袖，在近十幾年來(lái)受到生命科學(xué)匣摘、顯微成像店诗、計(jì)算機(jī)等等領(lǐng)域科學(xué)家的廣泛關(guān)注，并促使了一系列適合生物樣品成像的超分辨率成像技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用音榜。
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超分辨熒光顯微成像技術(shù)
單分子定位熒光顯微成像包括光激活定位顯微（PALM）和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微（STORM）庞瘸。兩者的原理相似，成像過(guò)程均需要往復(fù)循環(huán)赠叼，在每個(gè)循環(huán)周期里擦囊，熒光分子團(tuán)被連續(xù)的激活、成像及漂白嘴办。
PALM工作原理
光激活定位顯微技術(shù)photoactivated localization microscopy（PALM）其基本原理是首先使用光活化綠色熒光蛋白（PA-GFP）來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)瞬场，并將較低光功率的405nm 激光照射細(xì)胞表面，用于激活稀疏分布的幾個(gè)熒光分子涧郊。之后用561nm激光照射贯被，使已經(jīng)激活的熒光分子因?yàn)槭?mark class="span_mark" data-type="1">激發(fā)射而產(chǎn)生熒光信號(hào)，接著繼續(xù)照射使這些發(fā)光的熒光分子產(chǎn)生漂白妆艘， 在下一輪不能被激發(fā)光再次激活刃榨。之后交替使用405nm和561nm激光來(lái)進(jìn)行激活，激發(fā)和漂白其他的熒光分子双仍。往復(fù)循環(huán)枢希，直至全部完成稀疏標(biāo)記的細(xì)胞成像。圖1展示了使用光激活定位顯微技術(shù)PALM 定位單個(gè)熒光分子最后實(shí)現(xiàn)超光學(xué)衍射極限分辨率成像的示意圖朱沃。PALM的成像方法只能觀察基于細(xì)胞外源表達(dá)的蛋白質(zhì)苞轿。
圖1.PALM超分辨率顯微成像系統(tǒng)原理及示意圖
PALM超分辨系統(tǒng)系統(tǒng)部分組成及光路結(jié)構(gòu)：
（1）倒置熒光顯微鏡：可以用于激光掃描共焦顯微成像或者單分子PALM顯微成像。（2）半導(dǎo)體激光：405nm激光器作為激活光逗物，561nm激光器作為激發(fā)光搬卒，激光器波長(zhǎng)的選擇是要和使用的光活化蛋白的特性有關(guān)，用于激發(fā)熒光的激光器波長(zhǎng)一般包括488翎卓、561契邀、594、635nm失暴。激光器功率一般在50-200mW坯门。為了光路調(diào)節(jié)的方便，一般要求激光器輸出光斑質(zhì)量要好逗扒。（3）自由空間或光纖多波長(zhǎng)耦合器：自由空間耦合器可以使得更高功率的激發(fā)和激活激光進(jìn)入顯微鏡系統(tǒng)古戴，使得成像過(guò)程可以更快。（4）快門(mén)或AOTF(Acousto-Optic Tunable filter聲光可調(diào)濾波器)：快門(mén)或AOTF的作用是切換激活光和激發(fā)光矩肩，使得激活光和激發(fā)光依次照射在樣品上现恼，實(shí)現(xiàn)快速光開(kāi)關(guān)的目的。在空間光輸入到顯微鏡之前，使用AOTF可以使得進(jìn)入顯微鏡的光強(qiáng)最大叉袍。（5）激發(fā)濾光片始锚、二向色片、長(zhǎng)通濾光片：用于收集熒光信號(hào)最大喳逛，同時(shí)阻擋激發(fā)光疼蛾，使得保證信噪比，消除殘余光和自發(fā)熒光艺配。（6）TIRFM(全內(nèi)反射熒光顯微鏡)物鏡。TIRFM物鏡的作用是使光束在樣品表面發(fā)生全內(nèi)反射衍慎，用以提高圖像的信噪比转唉。同時(shí)TIRF物鏡的數(shù)值孔徑都比較大，會(huì)有比較好的光子收集效率稳捆。（7）emccd或scmos相機(jī)赠法。相機(jī)要在可見(jiàn)光范圍內(nèi)有較高的量子效率、較高的幀速乔夯、較低的噪聲砖织。
圖2. PALM成像效果
蛋白的激活和漂白通常需要多種窄線寬激光器。法國(guó)Oxxius激光器生產(chǎn)廠商則提供了這樣的合束激光器解決方案末荐，專(zhuān)門(mén)為生物視覺(jué)領(lǐng)域設(shè)計(jì)侧纯。
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