光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種可以對(duì)活體標(biāo)本進(jìn)行快速且無(wú)光毒性3D觀測(cè)的強(qiáng)大顯微成像技術(shù)尔崔，但從本質(zhì)上講答毫，光片顯微鏡通常基于熒光技術(shù)季春，研究中的樣品需要被正確標(biāo)記才能成像洗搂。使用低時(shí)間相干的超連續(xù)譜激光光源可以減少散射光在光片顯微鏡圖像中固有的散斑，是一種適用于無(wú)標(biāo)記結(jié)構(gòu)成像的新型光片成像方式载弄。
高性價(jià)比超連續(xù)譜激光器用于光片熒光顯微鏡
光片熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)
光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種可以對(duì)活體標(biāo)本進(jìn)行快速且無(wú)光毒性3D觀測(cè)的強(qiáng)大顯微成像技術(shù)耘拇。LSFM技術(shù)將寬場(chǎng)成像的速度與適度的光學(xué)切片和低光漂白特點(diǎn)相結(jié)合，因此也被稱為選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）宇攻，或簡(jiǎn)稱為“光片”惫叛。SPIM或LSFM共同的定義特征是從側(cè)面對(duì)焦平面進(jìn)行平面照明，在任何給定時(shí)間逞刷，僅對(duì)樣品的一小部分進(jìn)行照明嘉涌，因此與寬場(chǎng)輻射熒光相比，可以較大限度地減少光損傷并提供改善信噪比的光學(xué)切片夸浅。此外由于圖像是以寬場(chǎng)（2D平行）方式收集的洛心，因此光片成像比一次僅檢測(cè)一個(gè)像素的點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡快得多。
由于三個(gè)關(guān)鍵特性题篷，光片熒光顯微鏡正成為體積成像較流行的技術(shù)之一：
1.激發(fā)點(diǎn)被限制在焦平面附近，光損傷被Z小化厅目，生物可以存活更長(zhǎng)的時(shí)間番枚；
2.容易獲得良好的光學(xué)切片，通常接近共聚焦顯微鏡损敷；
3.采集速度非澈快，比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個(gè)數(shù)量級(jí)拗馒。
從本質(zhì)上講路星，光片顯微鏡通常基于熒光技術(shù)诱桂，一般來(lái)說(shuō)洋丐，研究中的樣品需要正確標(biāo)記才能成像。使用彈性散射光可以生成未標(biāo)記樣本的圖像挥等，但目前主要的障礙是這些圖像通常受到散斑的影響友绝。為了解決這個(gè)不便，Pablo Loza-Alvarez, Omar Alarte, David Merino of ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques with Diego Battista and Giannis Zacharakis of Foundation for Research and Technology-Hellas使用來(lái)自樣本的彈性散射光來(lái)生成圖像肝劲，以避免對(duì)樣品的標(biāo)記迁客。他們使用了低時(shí)間相干的超連續(xù)譜激光光源作為一種候選光源郭宝，以減少散射光在光片顯微鏡圖像中固有的散斑。
在這項(xiàng)工作中掷漱，他們提出了一種基于光片的新型光學(xué)裝置粘室，該裝置采用了三種方法來(lái)處理彈性散射圖像帶來(lái)的散斑，分別是偏振濾波卜范、降低激發(fā)光源的時(shí)間相干性和降低光片的空間相干性衔统，這些策略可以在不依賴熒光標(biāo)記的前提下使具有挑戰(zhàn)性的生物樣品結(jié)構(gòu)特征的原始光片彈性散射成像成為可能。
光片顯微鏡中的偏振和相干控制
在該實(shí)驗(yàn)中先朦，彈性散射光片顯微鏡的主要部件是來(lái)自西班牙FYLA公司的超連續(xù)譜光纖激光器缰冤，它發(fā)出從可見(jiàn)光到紅外光的寬帶光譜。該光源具有非常寬的光譜帶寬喳魏，同時(shí)棉浸，它呈現(xiàn)出非常低的時(shí)間相干性，這對(duì)于減少圖像中的散斑效應(yīng)都是非常重要的刺彩。對(duì)FYLA白色激光選擇500至700nm（140nm FWHM）的波段用于光片熒光顯微鏡迷郑，可以提供較低的時(shí)間相干性以降低散斑對(duì)比度。
圖1：彈性散射光片顯微鏡中偏振和相干控制的實(shí)驗(yàn)裝置示意圖创倔。圖（a）：光片照明光路由一對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)分別為515nm和638nm的二極管激光器和一個(gè)超連續(xù)譜激光器（SCL）組成嗡害。激光束在進(jìn)入顯微鏡之前被放大10倍。P1是一個(gè)半波片（HWP）畦攘，它在通過(guò)柱面透鏡（CL）霸妹、振鏡（GM）和照明物鏡（OBJill）之前控制三束光束的偏振。GM掃描OBJill瞳孔處的光束知押，在樣品平面上產(chǎn)生一個(gè)旋轉(zhuǎn)的光片叹螟。樣品保存在裝滿水的定制浸沒(méi)室（C）中。檢測(cè)系統(tǒng)由一個(gè)0.5N.A.物鏡（OBJdet）台盯、一個(gè)200mm管透鏡（總放大倍率為20X）和一個(gè)偏振器（P2）組成罢绽。圖（b）：FYLA激光器在500-700nm（140nmFWHM）波段的發(fā)射光譜，紅色垂直波段為紅色二極管激光器的帶寬（1.2nm）静盅。圖（c）：靠近照明物鏡（OBJill）的光學(xué)設(shè)置的細(xì)節(jié)良价，說(shuō)明了旋轉(zhuǎn)光片方法。FYLA激光片圍繞位于OBJill工作距離（WD）的軸旋轉(zhuǎn)蒿叠，即位于樣品平面的中心
FYLA超連續(xù)譜激光是否在LSFM中實(shí)現(xiàn)了無(wú)標(biāo)記的結(jié)構(gòu)成像?
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明明垢，與其他光譜帶寬較窄的光源相比，Iceblink超連續(xù)譜光源對(duì)LSM圖像的散斑貢獻(xiàn)較低栈虚，從而可以總結(jié)出彈性散射光片顯微鏡是一種適用于無(wú)標(biāo)記結(jié)構(gòu)成像的新型光片成像方式袖外。為了提高此配置中的成像質(zhì)量，他們還建議實(shí)施：1魂务、偏振控制曼验，可實(shí)現(xiàn)對(duì)比度選擇性并消除基板背景泌射。2、時(shí)間和空間相干性降低鬓照，可以從散斑噪聲中提取內(nèi)源性內(nèi)在對(duì)比度熔酷。
以這種方式實(shí)施，彈性散射光片成像為標(biāo)準(zhǔn)LSFM實(shí)驗(yàn)提供了有用的補(bǔ)充結(jié)構(gòu)信息豺裆，如MCTS樣品所示拒秘。此外，它有可能類似于組織切片但以非破壞性方式提供樣品的相關(guān)形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)臭猜。Z后躺酒，彈性散射光片顯微鏡是一種很有前途的技術(shù)，可以進(jìn)行新的有趣的實(shí)驗(yàn)蔑歌，例如羹应，在受低信噪比限制的應(yīng)用中替代LSFM，例如功能成像或快速體積結(jié)構(gòu)成像次屠。
圖2：使用彈性散射光片顯微鏡系統(tǒng)獲得的線蟲頭部圖像园匹。a）使用FYLA光源的蠕蟲頭部3D圖像堆棧的Z大強(qiáng)度投影（圖像尺寸為230×110μm）。b）是使用FYLA Iceblink光源獲得的（a）平面之一的細(xì)節(jié)（圖像為80×40μm）劫灶。c）是使用488nmCW二極管激光器獲得的與（b）相同的圖像（圖像為80×40μm）
來(lái)源文獻(xiàn)：
Enhanced Light Sheet elastic scattering Microscopy by Using a Supercontinuum Laser.
Diego Di Battista, David Merino, Giannis Zacharakis, Pablo Loza-Alvarez and Omar E. Olarte.
關(guān)于超連續(xù)激光器
超連續(xù)譜激光器（Supercontinuum Sources）又稱白光激光器裸违。2000年，RANKA等報(bào)道了在光子晶體光纖中產(chǎn)生2倍頻程的超連續(xù)譜本昏，超連續(xù)譜的產(chǎn)生為非線性光纖光學(xué)領(lǐng)域的研究注入了新的活力供汛。利用光子晶體光纖產(chǎn)生超連續(xù)譜是一種新型的光源，它具有高的輸出功率涌穆、平坦的寬帶光譜紊馏、高度的空間相干性（聚焦）等特性，能較大提高信噪比蒲犬、減小測(cè)量時(shí)問(wèn)以及加寬光譜測(cè)量范圍。光纖超連續(xù)譜光源可應(yīng)用在光纖衰減測(cè)量岸啡、干涉測(cè)量?jī)x原叮、光相十?dāng)z影術(shù)、光譜學(xué)分析巡蘸、生物成像奋隶、光學(xué)頻率梳等領(lǐng)域。
關(guān)于Iceblink超連續(xù)激光器
Iceblink是一款覆蓋450- 2300nm光譜范圍的超連續(xù)光纖激光器悦荒，具有超過(guò)1W的平均功率和較佳的穩(wěn)定性(0.5%標(biāo)準(zhǔn)偏差)唯欣。它是一種用途廣泛的白光光源，在科學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用搬味，典型應(yīng)用包括材料表征境氢、VIS蟀拷、NIR和IR光譜、單分子光譜和熒光激發(fā)的吸收/透射測(cè)量萍聊。 Iceblink的空間相干性和寬光譜范圍使其成為傳統(tǒng)燈源问芬、單波長(zhǎng)激光器、LED和ASE光源的不錯(cuò)替代品寿桨。
圖3：Iceblink超連續(xù)激光器實(shí)物圖
規(guī)格指標(biāo)：
圖4：Iceblink超連續(xù)激光器典型光譜
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