SPAD512*512像素單光子相機(jī)在相量分析法中熒光壽命測(cè)量的應(yīng)用

正文

在相量分析法中熒光壽命測(cè)量的應(yīng)用

一．簡(jiǎn)介

在現(xiàn)有的許多光學(xué)成像模式中，熒光壽命顯微成像技術(shù)（fluorescence lifetime imaging microscopy净蚤，F(xiàn)LIM）由于其多功能性和特異性在生物科學(xué)和材料科學(xué)中特別受歡迎钥组。熒光壽命顯微成像主要針對(duì)的是分子級(jí)別的成像，可以做到排除干擾分子后今瀑，對(duì)感興趣的分子進(jìn)行針對(duì)性的成像程梦，主要通過(guò)大量具有明顯吸收和發(fā)射光譜的熒光團(tuán)實(shí)現(xiàn)的点把。成為當(dāng)前分子層面上熒光測(cè)試的首先，廣泛應(yīng)用在DNA測(cè)序屿附、診斷郎逃、細(xì)胞成像、超分辨率顯微鏡挺份，甚至是應(yīng)用在疾病的縱向(前期)臨床研究和治療監(jiān)測(cè)的體內(nèi)成像褒翰。

相量分析法（phasor analysis，PA）可以通過(guò)時(shí)域和頻域的轉(zhuǎn)化直接進(jìn)行熒光壽命的檢測(cè)匀泊。與傳統(tǒng)的分析方法（比如Z小二乘法）相比优训，顯得更加的簡(jiǎn)便快速，對(duì)光子數(shù)量少的情形下的測(cè)量尤為重要各聘。數(shù)據(jù)信息的可視化和聚類分析的特點(diǎn)揣非，相量分析法成為了科研工作者分析熒光壽命的不錯(cuò)選擇。

門控單光子雪崩二極管(SPAD)陣列在相量- flim的廣域時(shí)間的上的應(yīng)用躲因，通過(guò)門長(zhǎng)度早敬、門數(shù)和信號(hào)強(qiáng)度可以提高測(cè)量壽命精度和準(zhǔn)確度。該探測(cè)器的功能基本上是一個(gè)理想的鏡頭噪聲限制傳感器毛仪，并能夠以視頻速率進(jìn)行FLIM測(cè)量搁嗓。即使在門的數(shù)量很少和光子數(shù)量有限的情況下，在這項(xiàng)工作中使用的相量方法似乎非常適合處理由這種類型的非常大的傳感器(512× 512像素)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)箱靴。

昊量光電推出了一款可以應(yīng)用于相量分析熒光壽命的設(shè)備腺逛，歡迎大家學(xué)習(xí)溝通。

二．相量分析法（Phasor-FLIM）的原理介紹

頻域法和時(shí)域法是相量分析法中核心衡怀，傅里葉變換技術(shù)可以讓兩者靈活轉(zhuǎn)變棍矛，但它們獲取熒光壽命信息的方式不同，得到的數(shù)據(jù)內(nèi)容和形式不同抛杨，從而數(shù)據(jù)處理方法一般也不同够委。頻域法一般使用正弦調(diào)制的連續(xù)光激發(fā)樣品，測(cè)量得到的是具有相同頻率的熒光信號(hào)怖现，但由于熒光壽命的影響茁帽，熒光信號(hào)的振幅和相位相比激發(fā)光均發(fā)生了變化，因此通過(guò)計(jì)算熒光信號(hào)相對(duì)激發(fā)光的振幅調(diào)制度變化和相位延遲可計(jì)算得到熒光壽命屈嗤。時(shí)域法則需要采用高重復(fù)頻率的飛秒脈沖激光激發(fā)樣品潘拨，利用前面提到的門控技術(shù)、掃描相機(jī)或 tcspc 技術(shù)等直接或間接記錄脈沖過(guò)后的熒光衰減過(guò)程饶号，得到的是熒光強(qiáng)度（或光子數(shù)）隨時(shí)間的變化關(guān)系铁追，因此一般可通過(guò)曲線擬合得到熒光壽命。

PA法先被用于處理頻域FLIM技術(shù)得到的熒光壽命數(shù)據(jù)茫船，其相量由頻域FLIM測(cè)量得到的解調(diào)系數(shù)和相位延遲來(lái)構(gòu)建琅束，是原始數(shù)據(jù)的直接表達(dá)扭屁。PA法同樣適用于時(shí)域FLIM數(shù)據(jù)的分析，但需要先將時(shí)域的熒光衰減變換到頻域。由 于時(shí)域FLIM中的TCSPC-FLIM目前應(yīng)用廣泛，因此 PA 法在該技術(shù)中的應(yīng) 用也是報(bào)道得較多的崎场。以下分別介紹這兩類技術(shù)中PA法分析熒光壽命的基本原理，并結(jié)合熒光相量圖的特點(diǎn)闡述其典型的應(yīng)用思路幔欧。

通過(guò)求解系統(tǒng)信號(hào)相移和解調(diào)系數(shù)，然后會(huì)求解壽命, 即:

其中 fi 為第 i 個(gè)調(diào)制頻率測(cè)得的光強(qiáng)占總光強(qiáng)的比例.

利用相量的概念對(duì)頻域法 FLIM 得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行幾何表示,他們利用單個(gè)像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的解調(diào)系數(shù)M和相移f來(lái)構(gòu)建一個(gè)相量,即以M作為該相量的模,以f作為該相量的輻角,則可以認(rèn)為相量與像素點(diǎn)是一一對(duì)應(yīng)的,相量圖上一個(gè)相量的端點(diǎn)就代表了一個(gè)像素點(diǎn)的全部熒光壽命信息 (如圖1(b) 所示).該相量在實(shí)軸和虛軸的分量可用 Weber 符號(hào)表示, 即:

對(duì)于單指數(shù)衰減情形, 可得到 cosf=M, 因此可以得到:

即以坐標(biāo)(G, S)表示的相量端點(diǎn)被約束在原心位于(0.5, 0)處丽声、半徑為 0.5 的半圓上礁蔗。半圓上的每個(gè)點(diǎn)表示不同的壽命，其壽命值從左到右遞減雁社，其中(1, 0)表示接近零的壽命浴井，(0, 0)表示無(wú)限長(zhǎng)的壽命，如圖 1(b)所示霉撵。則根據(jù)衰減組分間的線性疊加性質(zhì)磺浙，其在相量圖上對(duì)應(yīng)的相量端點(diǎn)應(yīng)位于半圓以內(nèi)，即多指數(shù)衰減過(guò)程對(duì)應(yīng)的 G 和 S 應(yīng)為：

幾何意義上徒坡，多指數(shù)衰減過(guò)程對(duì)應(yīng)的相量端點(diǎn)應(yīng)位于其各個(gè)單指數(shù)衰減組分對(duì)應(yīng)的壽命相量端點(diǎn)連接組成的集合內(nèi)撕氧。如圖 1(c)中，雙指數(shù)衰減過(guò)程對(duì)應(yīng)的壽命相量端點(diǎn)（藍(lán)色）落在半圓以內(nèi)喇完，位于兩個(gè)單指數(shù)衰減組分對(duì)應(yīng)的壽命相量端點(diǎn)（綠色）的連線上伦泥，且與兩端點(diǎn)的距離（p1、p2）由兩個(gè)組分的占比（α1锦溪、α2）決定不脯。

PA 法同樣適用于時(shí)域法 FLIM 數(shù)據(jù)的分析。這里以目前應(yīng)用廣泛的TCSPC-FLIM 技術(shù)為例刻诊。如圖 1(d)所示防楷，TCSPC 將每一次脈沖信號(hào)作為一個(gè)信號(hào)周期，每個(gè)周期內(nèi)當(dāng)探測(cè)到第①個(gè)熒光光子時(shí)就在其到達(dá)時(shí)間對(duì)應(yīng)的時(shí)間通道中進(jìn)行計(jì)數(shù)则涯，經(jīng)過(guò)多次累積即可建立一個(gè)反映熒光衰減過(guò)程的光子數(shù)-時(shí)間分布直方圖复局，用于求解熒光壽命。

圖1  熒光壽命的測(cè)量方法及相量分析 (PA) 法示意圖 (a) 頻域法測(cè)量原理示意圖; (b) 單指數(shù)衰減的壽命相量示例圖; (c) 雙指數(shù)衰減的壽命相量示例圖; (d) 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù) (TCSPC) 測(cè)量原理示意圖

三． 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3.1  SwissSPAD2技術(shù)概述

本文使用的探測(cè)器是SwissSPAD2 (SS2)粟判，這是一種高速肖揣、大尺寸SPAD成像傳感器，時(shí)間門集成在同一芯片上浮入。該傳感器芯片由512×512像素組成，在這里測(cè)試的相機(jī)模塊中羊异，只有472×256像素被啟用事秀。像素間距為16.38μm彤断，相鄰像素之間的串?dāng)_概率小于0.075%。由于每個(gè)像素的數(shù)字化特性(一個(gè)光子被檢測(cè)易迹，或沒(méi)有)宰衙，相機(jī)捕獲二進(jìn)制圖像，理想情況下是沒(méi)有讀出噪聲的睹欲，使其適合單光子成像供炼。每個(gè)像素有一個(gè)1位的存儲(chǔ)電子器件，整個(gè)陣列以較高97.7kfps(每秒千幀)的速度被讀取窘疮。每255個(gè)二進(jìn)制幀序列在現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列(FPGA)上累積成8位門圖像袋哼，通過(guò)USB3.0連接傳輸?shù)絇C機(jī)的數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)器。更詳細(xì)的SS2技術(shù)規(guī)格可以聯(lián)系我們進(jìn)一步溝通闸衫。

SS2使用其像素門電子技術(shù)進(jìn)行時(shí)間分辨成像涛贯。使用FPGA上的混合模式時(shí)鐘管理器(MMCM)模塊，從激光控制器(或快速激光拾取PIN二極管)傳輸?shù)较鄼C(jī)的激光觸發(fā)信號(hào)產(chǎn)生全局(陣列范圍)門信號(hào)蔚出。簡(jiǎn)單地說(shuō)弟翘，在每個(gè)1位的幀曝光期間(用戶可選擇Z大400ns，Z小50ns的倍數(shù))骄酗，在每個(gè)激光脈沖之后稀余，門被打開(kāi)或關(guān)閉，任何檢測(cè)到的光子都將像素存儲(chǔ)設(shè)置為1趋翻。如果檢測(cè)到多個(gè)光子睛琳，則忽略后續(xù)的光子。在設(shè)定曝光時(shí)間之后嘿歌，讀出1位幀掸掏，并重復(fù)該過(guò)程，直到獲得用戶定義的幀總數(shù)(8位門圖像通常為255宙帝，或10位門圖像為4×255)丧凤。然后將積累的門圖像傳輸?shù)絇C，同時(shí)定義一個(gè)新的門位置步脓，并重復(fù)這個(gè)過(guò)程以獲得一個(gè)新的門圖像愿待，以此類推，直到獲得所需數(shù)量的門圖像靴患。

SS2的柵極持續(xù)時(shí)間W比大多數(shù)常見(jiàn)的熒光團(tuán)壽命要長(zhǎng)得多(10 ns)仍侥，但相對(duì)于激光脈沖，可以非常精確地觸發(fā)鸳君，步驟為17.9 ps农渊。圖2說(shuō)明了典型柵極窗口的特征。通過(guò)記錄探測(cè)器對(duì)20MHz脈沖激光的響應(yīng)或颊，在50ns激光周期內(nèi)砸紊，利用階躍17.9 ps的門圖像传于，測(cè)量了該門曲線。圖中顯示了一個(gè)跨度為70納秒的窗口醉顽，但柵極剖面的周期為50納秒沼溜。

圖2所示  FLIM實(shí)驗(yàn)中使用的柵極特性。在中心472×256數(shù)組中每隔4個(gè)像素的響應(yīng)被繪制出來(lái)游添。Z小可達(dá)到的柵長(zhǎng)為10.8 ns

測(cè)試了七種柵極長(zhǎng)度W在10.8 ns ~ 22.8 ns之間的柵極構(gòu)型系草。門的長(zhǎng)度和位置決定了SPAD在每次激光脈沖后的敏感時(shí)間窗。在固定的激光頻率和強(qiáng)度下唆涝，較寬的光柵可以在給定的曝光時(shí)間內(nèi)收集更多的光子找都，但代價(jià)是較低的光子到達(dá)時(shí)間分辨率。正如我們將看到的石抡，這不是一個(gè)基本的極限檐嚣。該軟件允許選擇門配置(長(zhǎng)度)，每1位幀的激光脈沖數(shù)(曝光)啰扛，每個(gè)門圖像的位深度(8或10位)(動(dòng)態(tài)范圍)嚎京，兩個(gè)連續(xù)門位置之間的延遲(步長(zhǎng))，以及數(shù)據(jù)集中門圖像的數(shù)量隐解。

柵極特性影響時(shí)間分辨成像性能鞍帝，影響熒光壽命測(cè)定的準(zhǔn)確性和精密度。對(duì)于大視場(chǎng)系統(tǒng)煞茫，測(cè)量的空間均勻性是由柵邊位置分布或傾斜決定的帕涌。在大尺寸傳感器中，門信號(hào)的傾斜和高頻信號(hào)切換期間可能的電壓下降導(dǎo)致陣列的門邊緣非均勻性续徽。隨著柵極長(zhǎng)度的增加蚓曼，上升邊緣傾斜明顯縮小(在表1的Z后一行旁邊)。這種效應(yīng)可以歸因于信號(hào)轉(zhuǎn)換期間電源電壓波動(dòng)水平的差異钦扭。第①門信號(hào)躍遷(對(duì)應(yīng)于大門的下降沿窗口自門推進(jìn)對(duì)激光觸發(fā))導(dǎo)致門信號(hào)下降空間電源電壓不平衡樹(shù),結(jié)果在第②斜門信號(hào)轉(zhuǎn)變,在這種情況下,上升的邊緣纫版。隨著柵極長(zhǎng)度的增加，在較長(zhǎng)的過(guò)渡延遲期間客情，電壓降的較好的恢復(fù)降低了歪斜其弊。由于柵門不均勻性的來(lái)源是確定的，它可以通過(guò)測(cè)量后的校準(zhǔn)校正膀斋，如下一節(jié)所述梭伐。

閘門性能的另外兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是上升和下降時(shí)間。它們的主要影響因素是激光脈沖寬度仰担、SPAD響應(yīng)糊识、門信號(hào)抖動(dòng)以及門晶體管的開(kāi)關(guān)速度。后者是由制造工藝約束決定的。由于電源電壓擺幅隨這些參數(shù)的變化技掏，柵邊的陡度也取決于讀出速度和激光頻率铃将。因此，時(shí)間分辨率受到一系列隨機(jī)效應(yīng)的影響哑梳，其中一些我們無(wú)法控制，因此在這項(xiàng)工作中沒(méi)有研究它們的影響绘盟。

SS2 10.5%的原生填充因子可以通過(guò)微透鏡進(jìn)行部分補(bǔ)償鸠真。此次實(shí)驗(yàn)描述了，使用兩個(gè)SS2相機(jī)(一個(gè)有微鏡頭龄毡，一個(gè)沒(méi)有微鏡頭)吠卷，使用相同的相機(jī)曝光和照度設(shè)置，連續(xù)拍攝convallaria majalis樣本圖像沦零。濃度因子(CF)定義為μm/μnm的比值祭隔，其中μm和μnm分別為有微透鏡和無(wú)微透鏡相機(jī)的平均光子數(shù)減去探測(cè)器暗計(jì)數(shù)后的CF=2.65，對(duì)應(yīng)的有效填充因子為27.8%路操。

由于這一濃度因子低于理論計(jì)算值疾渴，我們?cè)谝粋€(gè)簡(jiǎn)單的光學(xué)裝置上測(cè)試了這兩個(gè)傳感器，其中傳感器和準(zhǔn)直激光束(785nm, PiLas, a.l.s.屯仗，德國(guó))之間的角度可以在兩個(gè)維度上進(jìn)行調(diào)整搞坝。對(duì)兩種傳感器進(jìn)行了連續(xù)測(cè)試，測(cè)量出總光子數(shù)隨入射角的變化魁袜。通過(guò)該方法計(jì)算得到桩撮，在3.5 V剩余偏置電壓下，較佳角度下的Z大濃度因子為4.46峰弹。這種與正常入射CF的差異可能是由于微透鏡陣列相對(duì)于SPAD陣列的輕微錯(cuò)位或微透鏡特性的局部變化造成的店量。

表1總結(jié)了SS2的性能，并將其與其他的大畫幅科學(xué)相機(jī)進(jìn)行了比較鞠呈。SPAD相機(jī)由于其數(shù)字特性融师，理想的讀出噪聲為零，因此它們可以用單光子靈敏度執(zhí)行廣域FLIM粟按。與MCPs和基于光電陰極的探測(cè)器相比诬滩，他們的cmos技術(shù)是可擴(kuò)展的，健壯的和經(jīng)濟(jì)的灭将。在SPAD相機(jī)中疼鸟，SS2采用了迄今為止較大的陣列尺寸，既能實(shí)現(xiàn)寬視場(chǎng)庙曙，又能實(shí)現(xiàn)高空間分辨率空镜。

表1 參數(shù)列表

3.2 設(shè)備介紹

SPAD512²是一個(gè)512×512像素的單光子雪崩二極管圖像傳感器。它可以使光子計(jì)數(shù)達(dá)到每秒10萬(wàn)幀，讀出噪聲為零吴攒。 Global shut可以實(shí)現(xiàn)納秒級(jí)曝光张抄，曝光偏移為18 ps。該陣列優(yōu)化為低噪聲洼怔，典型的暗計(jì)數(shù)率小于25 cps署惯。

表2 SPAD512²參數(shù)

圖3  PDP 特性曲線

外觀以及通訊接口：

3.3 影響數(shù)據(jù)的因素處理

獲得的數(shù)據(jù)需要通過(guò)堆積校正，背景校正镣隶，降低噪聲等手段獲得理想的信息极谊。由于攝像機(jī)存儲(chǔ)方案，記錄的信號(hào)不會(huì)與入射信號(hào)線性縮放安岂。雖然這種校正方法有助于恢復(fù)入射衰減剖面轻猖，但堆積能顯著降低信噪比(SNR)。在計(jì)算相量時(shí)域那，必須考慮由探測(cè)器噪聲引起的不相關(guān)背景信號(hào)咙边。背景不相關(guān)有多重效應(yīng)。雖然這些方法不能減輕背景光子引起的色散的輕微增加次员，但它們改善了計(jì)算相量的位置和隨后的分析败许。由于制造過(guò)程的不完善，陣列中有一小部分SPADs具有高暗計(jì)數(shù)率翠肘。所以可以設(shè)置一些感興趣的關(guān)注點(diǎn)檐束，對(duì)于感興趣區(qū)域或ROI進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，而不是單個(gè)像素值進(jìn)行分析束倍，此時(shí)暗計(jì)數(shù)對(duì)計(jì)算出的ROI相量的影響減小被丧，因此在大多數(shù)情況下可以忽略。

3.4 時(shí)間門控?cái)?shù)據(jù)相量分析

3.4.1 相量校準(zhǔn)

在實(shí)際應(yīng)用中绪妹，實(shí)驗(yàn)門的形狀和激光脈沖與觸發(fā)信號(hào)之間的時(shí)間延遲(偏置)都會(huì)影響采集硬件記錄的衰減的形狀甥桂，衰減是采樣信號(hào)與儀器響應(yīng)函數(shù)(IRF)的卷積。使用已知壽命的校準(zhǔn)樣本邮旷，可以很容易地校正IRF的效應(yīng)黄选。在相量表示中，IRF的存在只是對(duì)理論相量的模量進(jìn)行縮放婶肩，并將其相量旋轉(zhuǎn)一個(gè)固定的量(樣本相量乘以IRF相量)办陷。

利用定標(biāo)樣品的理論相量可以測(cè)量定標(biāo)樣品的未校正相量得到紅外光譜相量。

圖4 相量法的概念說(shuō)明  (a)固定寬度W的柵極在50 ns熒光衰減周期內(nèi)被掃描律歼。每個(gè)柵極與一個(gè)納米時(shí)間相關(guān)聯(lián)民镜，指定其相對(duì)于激光脈沖的開(kāi)始時(shí)間。門圖像中的每個(gè)像素包含在門口發(fā)現(xiàn)的光子數(shù)圖像曝光時(shí)間险毁。(b)的相量衰變(P)記錄在給定像素的加權(quán)平均計(jì)算門圖像強(qiáng)度乘以一個(gè)余弦或正弦項(xiàng)根據(jù)門時(shí)間)

事實(shí)上制圈，相同的校準(zhǔn)方法通趁峭可以很好地糾正由門控過(guò)程帶來(lái)的衰減修正，這相當(dāng)于一個(gè)積分鲸鹦，而不是卷積：

其中是一個(gè)校準(zhǔn)因子慧库，結(jié)合了IRF和Gate對(duì)記錄的衰減的影響。式(8)在本工作中所研究的所有情況下都能令人滿意地工作馋嗜，只要門數(shù)G不太衅氚濉（實(shí)際G>10）。

校準(zhǔn)因子可以為每個(gè)像素(使用相量校準(zhǔn)圖像)葛菇，或?yàn)槊總€(gè)ROI(使用相量校準(zhǔn)地圖)覆积，或?yàn)檎麄€(gè)幀全局(單相量校準(zhǔn))計(jì)算。在本研究中熟呛，由于柵極特性，我們計(jì)算了覆蓋整個(gè)視場(chǎng)的連續(xù)4×4像素ROIs的校準(zhǔn)因子尉姨。

四． 結(jié)果：

4.1 SS2時(shí)間門控?cái)?shù)據(jù)記錄

圖5  (a)ATTO 550庵朝，(b)Cy3B， (c)羅丹明6G(R6G)又厉，和(d)量子點(diǎn)(QD585)溶液的門強(qiáng)度曲線(坐標(biāo)(193,190))九府。參數(shù):激光頻率:20 MHz，門寬W = 13.1 ns覆致，位深:10侄旬，背景校正:off。藍(lán)色:無(wú)堆積修正煌妈，紅色:堆積修正儡羔。

圖5顯示了本文各種實(shí)驗(yàn)中使用的四種市售熒光樣品的熒光衰減譜，由SS2用W = 13.1 ns柵極寬度和17.86 ps柵極步長(zhǎng)(總共2800個(gè)柵極)記錄璧诵。ATTO 550, Cy3B和羅達(dá)明6G (R6G)樣品(圖5(a) (c))是水溶液夾在由1mm厚橡膠墊圈隔開(kāi)的兩個(gè)玻璃覆蓋物之間汰蜘，允許測(cè)試探測(cè)器的寬場(chǎng)響應(yīng)均勻性。這些樣本還被用于研究相量分析性能對(duì)各種采集參數(shù)的依賴性之宿，如后面一節(jié)所述族操。圖5(d)顯示了水量子點(diǎn)(QD)樣品(Qdot585 Streptavidin, ThermoFisher Scientific, 1 μM)在玻璃覆蓋層上晾干后的衰減剖面，導(dǎo)致了隨機(jī)的不均勻密度模式比被，其特征是視場(chǎng)的平均相壽命不同色难，稍后將討論。三種染料溶液的濃度不同(水緩沖液的濃度為10nM-1μM)等缀， ATTO 550的濃度Z低枷莉，導(dǎo)致明顯的顆粒噪聲，而較亮的樣品R6G的影響Z小项滑。這一變化為研究光子計(jì)數(shù)對(duì)壽命測(cè)定性能的影響提供了機(jī)會(huì)依沮。

4.2  SS2數(shù)據(jù)相量分析

SS2的相量分析的結(jié)果與測(cè)量數(shù)據(jù)如圖6所示的三個(gè)熒光染料與類似的激發(fā)和發(fā)射光譜(吸收峰約550nm,發(fā)射峰周圍570nm),但不同的一生:Cy3B R6G和阿550(文獻(xiàn)值:τ= 2.8 ns,分別4.08 ns和3.6 ns)涯贞。在實(shí)驗(yàn)中，用脈沖寬度為100 ps的532 nm 20 MHz脈沖激光器(LDH-P-FA-530XL, PicoQuant危喉，德國(guó))激發(fā)所有染料溶液宋渔。選擇ATTO 550作為中間壽命物種，計(jì)算一個(gè)分置(4 4)校準(zhǔn)圖辜限，用于校準(zhǔn)其他兩種染料樣品(Cy3B &R6G)皇拣，在方法中解釋。ATTO 550薄嫡、Cy3B和R6G具有相似的光物理性質(zhì)氧急，但在532 nm激發(fā)時(shí)，R6G比其他兩種光略亮(比Cy3B亮兩倍毫深，比ATTO 550亮三倍)吩坝。此外，由于ATTO 550樣品的濃度低于另外兩個(gè)樣品哑蔫，我們用較大的積分時(shí)間對(duì)其較低的信號(hào)進(jìn)行補(bǔ)償(另外兩個(gè)樣品用10位數(shù)據(jù)代替8位數(shù)據(jù))钉寝。計(jì)算的相位散點(diǎn)圖。

圖6(a)-(c)分別表示2800闸迷、140和16個(gè)柵極位置計(jì)算的相量散點(diǎn)圖嵌纲。由于總信號(hào)的減少，相量色散明顯地隨著門數(shù)的減少而增加腥沽。然而逮走，這兩個(gè)物種仍然可以通過(guò)16門來(lái)分辨，有效幀率為12.1 fps今阳，這表明對(duì)于這些壽命差異為1.4 ns的特定樣本师溅，在實(shí)時(shí)采集速度下可以對(duì)相量圖上的染料進(jìn)行識(shí)別。

相量值可以轉(zhuǎn)換為相位壽命值(使用公式(5))酣栈，從而得到具有平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的正態(tài)分布险胰，如表2所示。與文獻(xiàn)值相比矿筝，測(cè)量的壽命顯示了輕微的負(fù)偏置(Cy3B為300 ps或10%起便，R6G為200 ps或5%)，但與使用配備不同脈沖激光源的共聚焦TCSPC裝置測(cè)量的結(jié)果相匹配(數(shù)據(jù)未顯示)窖维。它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差尺度為g-1 /2榆综，其中G是用于計(jì)算的門的數(shù)量，就像預(yù)期的射擊噪聲限制信號(hào)(公式(12))铸史，因?yàn)橛?jì)數(shù)的數(shù)量與用于分析的門的數(shù)量成比例鼻疮。

圖6   R6G(τ = 4.08 ns)和Cy3B (τ=2.8ns)在2,800 (a)、140 (b)和16 (c)門位置得到的解的相量散點(diǎn)圖琳轿，并使用對(duì)應(yīng)的ATTO 550數(shù)據(jù)集(τ= 3.6 ns)校準(zhǔn)判沟。當(dāng)使用更少的門(因此也就更少的光子)時(shí)耿芹，兩個(gè)樣品相量的視覺(jué)分離變得更具挑戰(zhàn)性。即使只有16個(gè)柵極挪哄，這兩個(gè)樣本也能明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)吧秕。實(shí)驗(yàn)參數(shù):激光和相量頻率:20 MHz，門寬:13.1 ns迹炼，陣列尺寸:472 256砸彬，箱數(shù):4 4，位深:8 (R6G &Cy3B)斯入，16 (ATTO 550)砂碉，堆積校正:開(kāi)啟，背景校正:開(kāi)啟刻两，移除像素百分比:0% (R6G &Cy3B)增蹭，0.5% (atto550)

表3。從圖6中得到的相位壽命和標(biāo)準(zhǔn)偏差(以ns為單位)磅摹。測(cè)得的相壽命略短于文獻(xiàn)值(Cy3B: 2.8 ns, R6G: 4.08 ns)沪铭，公式(12)的標(biāo)準(zhǔn)差為g-1 /2。

4.3復(fù)雜樣本的階段生命周期圖

相量法的一個(gè)強(qiáng)大的方面是它在相量圖中對(duì)樣本壽命的二維表示偏瓤。物種的特征是一個(gè)指數(shù)衰減與τ一生都位于一個(gè)定義良好的地區(qū)接近通用圓(加州大學(xué)),很容易區(qū)分與不同時(shí)間的樣品(見(jiàn)例如圖6)。一個(gè)示例包括兩個(gè)熒光物種不同壽命局部獨(dú)立的地區(qū)在圖像中椰憋，相量圖將在相量圖中顯示兩個(gè)單獨(dú)的相量簇厅克。然后簡(jiǎn)單關(guān)聯(lián)的位置相量的相量圖和相應(yīng)的位置在圖像來(lái)源,例如紅色和綠色都表示測(cè)量出了不同壽命值。在任何其他情況下(例如橙依，當(dāng)不同的物種具有不同的生存期证舟，但在圖像中集中)，相量將是中間的窗骑，并且就生存期而言的解釋更加微妙女责，但仍然可以使用類似的和有用的顏色映射，如下所示创译。

說(shuō)明這個(gè)實(shí)用方面的相量圖SS2特定情況下的傳感器,我們研究的樣本一樣商業(yè)量子點(diǎn)發(fā)射光譜范圍前面所討論的有機(jī)染料樣品(Qdot 585鏈霉親和素,峰值發(fā)射波長(zhǎng):585nm),但是更長(zhǎng)的壽命(參見(jiàn)圖5 (d))抵知。量子點(diǎn)(QDs)除了具有較長(zhǎng)的壽命外，通常還表現(xiàn)出尺寸上的多分散性软族，這導(dǎo)致其光物理性質(zhì)(如發(fā)射光譜峰值刷喜、壽命等)的異質(zhì)性，這也取決于其所處的環(huán)境立砸。

將該QD樣品的10μl原液(濃度為1μM)放在蓋玻片上晾干掖疮，并使用與之前測(cè)量相同的設(shè)置在環(huán)境條件下成像。對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度圖像如圖7(a)所示颗祝，其特征是高QD濃度的明亮隨機(jī)條紋浊闪，點(diǎn)綴著低濃度的區(qū)域(條紋和干燥的微滴區(qū)域)恼布。該圖像中每個(gè)像素的相量(使用前一節(jié)描述的Cy3B樣本校準(zhǔn))表示為圖7(d)所示的二維直方圖。相位壽命τR = 13.9 ns和τG = 16.7 ns均較接近UC搁宾，并沿紅點(diǎn)和綠點(diǎn)排列折汞。使用每個(gè)相量與這兩個(gè)參考點(diǎn)的相對(duì)距離(或相量比rG，公式(16))對(duì)源圖像中的原始像素進(jìn)行顏色編碼(rG = 0:紅色猛铅，rG = 1:圖7(b))所示的藍(lán)色字支，中間光譜顏色比例圖，產(chǎn)生圖7(b)所示的相量圖奸忽，其中每個(gè)像素的顏色對(duì)應(yīng)于其相量比堕伪。

將該QD樣品的10μl原液(濃度為1μM)放在蓋玻片上晾干，并使用與之前測(cè)量相同的設(shè)置在環(huán)境條件下成像栗菜。對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度圖像如圖7(a)所示欠雌，其特征是高QD濃度的明亮隨機(jī)條紋，點(diǎn)綴著低濃度的區(qū)域(條紋和干燥的微滴區(qū)域)疙筹。該圖像中每個(gè)像素的相量(使用前一節(jié)描述的Cy3B樣本校準(zhǔn))表示為圖7(d)所示的二維直方圖富俄。相位壽命τR = 13.9 ns和τG = 16.7 ns均較接近UC，并沿紅點(diǎn)和綠點(diǎn)排列而咆。使用每個(gè)相量與這兩個(gè)參考點(diǎn)的相對(duì)距離(或相量比rG霍比，公式(16))對(duì)源圖像中的原始像素進(jìn)行顏色編碼(rG = 0:紅色，rG = 1:圖7(b))所示的藍(lán)色暴备，中間光譜顏色比例圖悠瞬，產(chǎn)生圖7(b)所示的相量圖，其中每個(gè)像素的顏色對(duì)應(yīng)于其相量比涯捻。

圖7  QD階段生命周期圖浅妆。(a):干燥QD樣品的強(qiáng)度圖像拌阴。對(duì)比度已經(jīng)調(diào)整启摄，可以看到大部分的視野。比例尺為25 μm烟馅。(b)涛浙，(c):用顏色編碼的階段壽命圖康辑。兩個(gè)引用(綠點(diǎn):16.7 ns和紅點(diǎn):13.9 ns)定義的相量圖(d)所示。像素顏色根據(jù)他們的相量比這兩個(gè)引用和使用b轿亮。像素的光譜顏色規(guī)模表示相量接近第①個(gè)參考(綠點(diǎn):較長(zhǎng)的生命周期)被標(biāo)記為藍(lán)色晾捏，而相量接近第②個(gè)參考點(diǎn)的像素(紅點(diǎn):較短的生命周期)被標(biāo)記為紅色。像素與相量之間的顏色與一個(gè)中間顏色哀托。線段外的點(diǎn)根據(jù)線段上Z近的點(diǎn)著色惦辛。細(xì)長(zhǎng)的六邊形代表相量圖區(qū)域的邊界，適用于這種顏色編碼方案仓手。在b中胖齐，對(duì)所有像素保持相同的亮度玻淑，不管它們的實(shí)際強(qiáng)度，允許顯示低強(qiáng)度像素(和它們的相位壽命)呀伙。壽命與強(qiáng)度之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性补履，而濃度與壽命之間似乎存在相關(guān)性。(d):底部:a所示數(shù)據(jù)的相量圖剿另。頂部:底部相量圖所選方形區(qū)域的細(xì)節(jié)箫锤。兩個(gè)參考點(diǎn)(綠點(diǎn)和紅點(diǎn))在相量云的兩端都可見(jiàn)。

五． 討論

在這項(xiàng)工作中雨女，我們研究了一種新的寬視場(chǎng)時(shí)間門控SPAD陣列的FLIM使用相量方法的性能谚攒。在該傳感器中，我們實(shí)現(xiàn)了相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間門氛堕。這種設(shè)計(jì)選擇與大多數(shù)時(shí)間門控檢測(cè)器不同馏臭，它需要降低每個(gè)像素的間距并將陣列放大到較大的格式，而時(shí)間門控檢測(cè)器則力求實(shí)現(xiàn)盡可能短的門控持續(xù)時(shí)間讼稚，以模擬TCSPC技術(shù)的性能括儒。此外，每個(gè)像素的數(shù)據(jù)內(nèi)容為1位锐想，對(duì)應(yīng)于每個(gè)讀出周期的光子計(jì)數(shù)為1或0帮寻。傳感器的這種特性導(dǎo)致需要在像素級(jí)進(jìn)行堆積校正。

大視場(chǎng)時(shí)分辨成像系統(tǒng)的整體性能可以用兩種不同的方式來(lái)定義赠摇。第①種方法是找到所需的時(shí)間规婆，以給定的精度確定一個(gè)固定像素區(qū)域的生命周期，對(duì)照明級(jí)別沒(méi)有限制蝉稳。該參數(shù)由減少的光子經(jīng)濟(jì)(由測(cè)量壽命或f值上的歸一化相對(duì)誤差表示，公式(9))和Z大本地光子計(jì)數(shù)率決定掘鄙。然而耘戚，在某些情況下，可接受的照明水平是有限制的操漠。在發(fā)射強(qiáng)度在探測(cè)器動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的情況下收津，系統(tǒng)的性能由像素的靈敏度和光子效率決定。要定義SS2的當(dāng)前和潛在功能浊伙，必須很好地理解每個(gè)參數(shù)的限制撞秋。

根據(jù)定義，Z大局部計(jì)數(shù)率是兩個(gè)可探測(cè)光子之間的Z小延遲的倒數(shù)嚣鄙。在SS2的全局快門模式下吻贿，由于像素內(nèi)存儲(chǔ)器只能存儲(chǔ)一個(gè)光子，所以這個(gè)延遲等于曝光和讀出時(shí)間的總和哑子。如果SPAD在一幀中檢測(cè)到一個(gè)以上的光子舅列，那么除了第①個(gè)光子外肌割，所有的光子都會(huì)被錯(cuò)過(guò)。這種現(xiàn)象被稱為堆積帐要，會(huì)導(dǎo)致熒光衰減形狀的扭曲把敞。這里使用的堆積校正(式(1))部分恢復(fù)了光子分布;然而，它不能改善由于光子丟失而引起的信噪比下降榨惠。為了減少堆積奋早，所有門的每幀平均光子數(shù)必須保持在1以下。為了計(jì)算Z大局部計(jì)數(shù)率赠橙，可接受堆積的Z大允許光子計(jì)數(shù)必須乘以門響應(yīng)的平均強(qiáng)度和峰值強(qiáng)度的比值耽装，該比值受樣品壽命門長(zhǎng)度和激光脈沖寬度的影響。增加像素內(nèi)存儲(chǔ)器的位深度或讀取速度是增加Z大計(jì)數(shù)率的兩種可能方法简烤，代價(jià)是增加后脈沖(這將顯示為FLIM pur姿態(tài)的背景噪聲)剂邮。這兩種解決方案都需要額外的芯片面積，因此它們會(huì)帶來(lái)填充因子的損失或像素大小的增加横侦。

該成像儀的靈敏度由SPAD的光子探測(cè)效率和像素死區(qū)時(shí)間決定挥萌。PDE是SPAD檢測(cè)到的入射光子的百分比，等于PDP和填充因子的乘積枉侧。為了改善偏微分方程引瀑，在成像儀上沉積了微透鏡。SS2上微透鏡的濃度因子在2.6 (Vex = 6.5 V)到4.5 (Vex = 3.5 V)之間榨馁，有效填充因子在28%到47%之間憨栽。死時(shí)間是傳感器操作期間對(duì)光子不敏感的時(shí)間。SS2在低堆積狀態(tài)下工作時(shí)翼虫，死區(qū)時(shí)間包括全局快門模式下的讀出時(shí)間和柵門關(guān)閉時(shí)激光周期的持續(xù)時(shí)間屑柔。第①個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)切換到卷簾模式來(lái)解決，在這種模式下曝光和讀數(shù)同時(shí)發(fā)生珍剑。對(duì)于目前的芯片版本掸宛，此操作需要對(duì)配電網(wǎng)進(jìn)行改進(jìn)。第②個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)向像素添加第②個(gè)門來(lái)解決招拙。這種雙柵結(jié)構(gòu)使像素在整個(gè)激光周期內(nèi)都是敏感的唧瘾，同時(shí)通過(guò)將光子分配到兩個(gè)門中的一個(gè)來(lái)記錄時(shí)間信息。有了這兩個(gè)附加條件别凤，死時(shí)間就可以幾乎消除了饰序。

六． 總結(jié)

在接近視頻速率(12.4 fps，圖7(b))的情況下规哪，實(shí)現(xiàn)良好的壽命精度和高精度(140 ps)的能力是實(shí)時(shí)FLIM的一個(gè)令人鼓舞的里程碑求豫。為了充分實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，下一步將涉及到FPGA上實(shí)現(xiàn)相量計(jì)算，實(shí)現(xiàn)高吞吐量的數(shù)據(jù)處理注祖。復(fù)雜混合物中物種組分的提取也是flam - fret測(cè)量的重要一步猾蒂。提高靈敏度，實(shí)時(shí)時(shí)間門控成像和多物種量化的結(jié)合將擴(kuò)展該傳感器的能力是晨，以滿足高速和高精度的應(yīng)用肚菠，如小動(dòng)物成像。

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