自適應(yīng)光學(xué)+貝塞爾光束+雙光子熒光實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率在體體積成像

正文

自適應(yīng)光學(xué)+貝塞爾光束+雙光子熒光實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率在體體積成像

技術(shù)背景：

活生物體的生物過(guò)程成像需要具有三維高時(shí)空分辨率率的光學(xué)顯微成像手段。如另锋，在體腦成像需要亞微米空間分辨率區(qū)分突觸(synapses)滞项、神經(jīng)元用來(lái)通訊和協(xié)調(diào)活動(dòng)(communicate and coordinate activity)的特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等，以及亞秒級(jí)時(shí)間分辨率來(lái)追蹤神經(jīng)元活動(dòng)夭坪。盡管在一個(gè)體積內(nèi)(如跨同一神經(jīng)元的樹(shù)突)研究突觸活動(dòng)是常用的手段文判，但是仍然缺乏能以高時(shí)空分辨率對(duì)突觸進(jìn)行三維成像的方法。

在體成像技術(shù)中室梅，雙光子熒光顯微鏡(two-photon fluorescence microscopy, 2PFM)是對(duì)大腦這樣的不透明組織進(jìn)行成像的z流行技術(shù)戏仓，其微小的雙光子吸收截面將熒光產(chǎn)生限制在顯微鏡物鏡的聚焦體積內(nèi)疚宇。為了對(duì)樣品中的單個(gè)光學(xué)截面進(jìn)行成像，2PFM在二維掃描激發(fā)焦點(diǎn)并記錄每個(gè)位置的熒光信號(hào)赏殃，衍射極限焦點(diǎn)提供z亮的熒光信號(hào)以及z高的空間分辨率敷待。然而，只有通過(guò)自適應(yīng)光學(xué)(adaptive optics, AO)才能維持在體深度的高空間分辨率嗓奢，自適應(yīng)光學(xué)可以測(cè)量和校正成像光穿過(guò)光異質(zhì)樣品時(shí)在波前積累的光學(xué)像差讼撒。AO與2PFM相結(jié)合浑厚，將校正的相位模式應(yīng)用于物鏡后瞳平面(back pupil plane)的激發(fā)波前股耽，可以實(shí)現(xiàn)衍射極限性能，并且可以在大腦表面以下數(shù)百微米處解析突觸钳幅。

大腦的在體成像也需要高時(shí)間分辨率物蝙，對(duì)于大腦內(nèi)的功能成像，需要亞秒級(jí)的時(shí)間分辨率來(lái)跟上神經(jīng)元活動(dòng)的產(chǎn)生和傳播敢艰。傳統(tǒng)的2PFM通過(guò)在三個(gè)維度上依序掃描其激發(fā)焦點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)三維成像诬乞，這導(dǎo)致體積成像速率遠(yuǎn)低于其二維幀率。使用貝塞爾光束作為激發(fā)焦點(diǎn)的體積2PFM成像钠导，可以對(duì)焦點(diǎn)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)軸向拉長(zhǎng)但是橫向受限震嫉，從而能夠同時(shí)對(duì)由二維掃描區(qū)域和貝塞爾焦點(diǎn)的軸向長(zhǎng)度定義的體積內(nèi)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，將二維幀速率轉(zhuǎn)換為三維體積速率牡属。

然而票堵，就像通過(guò)完全照射物鏡back pupil形成的傳統(tǒng)雙光子激發(fā)焦點(diǎn)一樣，通過(guò)用環(huán)形pattern照射pupil形成的貝塞爾焦點(diǎn)也會(huì)經(jīng)歷樣品引起的像差逮栅，在傳播通過(guò)像差媒介后降低光束輪廓悴势。貝塞爾聚焦質(zhì)量如何受光學(xué)像差影響，以及如何校正這些像差以在深度上恢復(fù)衍射極限性能仍然還知之甚少措伐。

技術(shù)要點(diǎn)：

基于此特纤，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的Wei Chen(一作)和Na ji(通訊)提出一種有效的自適應(yīng)光學(xué)方法，可以校正物鏡焦平面上貝塞爾焦點(diǎn)的失真波前侥加，并恢復(fù)衍射極限成像性能捧存，從而實(shí)現(xiàn)在體體積成像的高時(shí)空分辨率。作者將AO Bessel聚焦掃描2PFM應(yīng)用于深度上達(dá)500um的斑馬魚(yú)幼苗和小鼠大腦體積成像担败，證明了在體突觸結(jié)構(gòu)和功能測(cè)量的靈敏度和分辨率的顯著提升昔穴，從而能以高精度對(duì)突觸鈣和谷氨酸活性進(jìn)行體積測(cè)量(包括同時(shí)記錄小鼠皮層中頂端和基底樹(shù)突棘的谷氨酸活性)。

(1)從理論上和實(shí)驗(yàn)上表征了不同像差模式如何影響2PFM中貝塞爾焦點(diǎn)的質(zhì)量氢架。

(2)通過(guò)在物鏡焦平面而不是傳統(tǒng)AO中的光瞳(pupil)平面控制激發(fā)波前傻咖，開(kāi)發(fā)了一種高效且有效的像差校正方法，從而能夠恢復(fù)衍射極限成像性能岖研。

圖1卿操、高效像差校正用于貝塞爾焦點(diǎn)掃描2PFM

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖2警检、像差校正恢復(fù)衍射極限分辨率用于斑馬魚(yú)幼苗在體體積成像

通過(guò)貝塞爾聚焦掃描在2 Hz的體積速率下以及無(wú)AO和有AO的情況下對(duì)體積(128×100×60 μm3，從Z=190μm到Z=250μm below pia)中GCaMP6s+樹(shù)突和樹(shù)突棘的自發(fā)鈣瞬變進(jìn)行成像害淤。

清醒小鼠在體視覺(jué)皮層神經(jīng)元基底樹(shù)突棘中視覺(jué)誘發(fā)谷氨酸信號(hào)(iGluSnFR-A184S)的體積成像扇雕。通過(guò)貝塞爾聚焦掃描在無(wú)AO和有AO(128×128×60μm3，從Z=120μm到Z=180μm below pia)的情況對(duì)比窥摄。視覺(jué)刺激：偽隨機(jī)序列中的12個(gè)全場(chǎng)漂移光柵(0° 至330°镶奉，增量為30°）。對(duì)每個(gè)刺激重復(fù)20次試驗(yàn)崭放，視頻為試驗(yàn)平均結(jié)果哨苛。

附錄：

AO高斯和AO貝塞爾焦點(diǎn)掃描2PFM光路

(a)位于激發(fā)激光器和2PFM之間的貝塞爾模塊照片。原始的高斯路徑(白虛線(xiàn))和貝塞爾路徑可以通過(guò)翻轉(zhuǎn)反射鏡切換(b)貝塞爾模塊零件清單

參考文獻(xiàn)：Chen, W., Natan, R.G., Yang, Y. et al. In vivo volumetric imaging of calcium and glutamate activity at synapses with high spatiotemporal resolution. Nat Commun 12, 6630 (2021).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26965-7

 

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