本文簡單介紹了雙光子顯微鏡的技術(shù)背景希柿，以及純相位液晶空間光調(diào)制器在雙光子顯微鏡進(jìn)行體積成像時(shí)提升成像的掃描速度和成像質(zhì)量的優(yōu)勢(shì)诊沪。美國Meadowlark Optics公司專注于模擬尋找純相位空間光調(diào)制器的生產(chǎn)設(shè)計(jì)，我們也簡單介紹了對(duì)于雙光子應(yīng)用中Meadowlark公司SLM非常適合的性能特點(diǎn)曾撤，如高刷新率端姚、高相位穩(wěn)定性、高損傷閾值等挤悉。
1436Hz純相位空間光調(diào)制器在雙光子/鈣離子成像中的應(yīng)用
一渐裸、引言
雙光子成像是利用雙光子吸收的一種成像技術(shù)，雙光子吸收是指原子或分子在時(shí)間和空間上同時(shí)吸收兩個(gè)光子而躍遷到高能級(jí)的現(xiàn)象装悲。因此反應(yīng)概率遠(yuǎn)小于一般的單光子吸收昏鹃，它的幾率正比于光強(qiáng)度的平方。神經(jīng)元鈣成像（calcium imaging）技術(shù)的原理就是借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系诀诊，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針（鈣離子指示劑洞渤，calcium indicator），將神經(jīng)元當(dāng)中的鈣離子濃度通過雙光子吸收激發(fā)的熒光強(qiáng)度表征出來畏梆，從而達(dá)到檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的您宪。
美國Meadowlark Optics公司專注于模擬尋找純相位空間光調(diào)制器的設(shè)計(jì)、開發(fā)和制造奠涌，有40多年的歷史宪巨，該公司空間光調(diào)制器產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于自適應(yīng)光學(xué)，散射或渾濁介質(zhì)中的成像溜畅，雙光子/三光子顯微成像捏卓，光遺傳學(xué)，全息光鑷(HOT)慈格，脈沖整形怠晴，光學(xué)加密，量子計(jì)算浴捆，光通信蒜田，湍流模擬等領(lǐng)域。其新推出的HSP1K（1024x1024）SLM系列的高刷新速度选泻、高損傷閾值冲粤、大通光孔面的特性十分適用于雙光子/多光子/鈣離子成像這一領(lǐng)域美莫。
圖1. Meadowlark 新推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM
二、雙光子/鈣離子成像技術(shù)介紹
雙光子激發(fā)顯微鏡（Two-photon excitation microscopy）是一種熒光成像技術(shù)梯捕，可以對(duì)活體組織進(jìn)行深度約1毫米的成像厢呵。它不同于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，其中激發(fā)波長短于發(fā)射波長傀顾，因?yàn)閮蓚€(gè)激發(fā)光子的波長長于所得發(fā)射光的波長襟铭。雙光子激發(fā)顯微通常使用近紅外（1064nm）激發(fā)光，可以激發(fā)熒光染料短曾。使用近紅外的好處是可z大限度地減少組織中的散射寒砖。由于多光子吸收，同時(shí)能夠減小背景噪聲嫉拐。這兩種效果都會(huì)導(dǎo)致這些顯微鏡的穿透深度增加入撒。
基于熒光指示劑的鈣成像提供了一種監(jiān)測(cè)動(dòng)作電位的光學(xué)方法，并被系統(tǒng)的用于補(bǔ)充微電極記錄椭岩，測(cè)量體內(nèi)的神經(jīng)元活動(dòng)。這種方法為重建小型模式生物體整個(gè)大腦中的神經(jīng)元群的活動(dòng)開辟了道路璃赡。鈣成像技術(shù)結(jié)合雙光子顯微鏡使得在體內(nèi)測(cè)量深層神經(jīng)元群體的活動(dòng)成為可能判哥。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展凉敲，純相位液晶空間光調(diào)制器在體鈣成像技術(shù)的應(yīng)用也得到了蓬勃發(fā)展睦霎。
圖2. 小鼠腸切片上的雙光子激發(fā)顯微鏡圖片。 紅色：肌動(dòng)蛋白缩筛。 綠色：細(xì)胞核侯谁。 藍(lán)色：杯狀細(xì)胞粘液锌仅。 通過鈦-藍(lán)寶石激光器在波長780 nm處激發(fā)獲得
三、LCoS-SLM在雙光子/鈣離子成像中的應(yīng)用
在經(jīng)典的雙光子掃描顯微鏡中墙贱，飛秒激光束被聚焦到一個(gè)衍射有限的光點(diǎn)热芹，并在樣品上掃描。發(fā)出的熒光被一個(gè)光電倍增管接受惨撇，其時(shí)間信號(hào)被映射到相應(yīng)的像素上伊脓，zui終形成圖像。由于樣品被激發(fā)魁衙，信號(hào)是被逐點(diǎn)采集的报腔，這種方法克服了散射組織的廣域成像中像素交叉干擾。由于雙光子顯微鏡具有更高的光收集效率剖淀、更深的穿透力和更低的光毒性纯蛾，通常是共焦顯微鏡的良好替代方案。
但雙光子顯微鏡或任何激光掃描顯微鏡的致命弱點(diǎn)是它緩慢的速度纵隔，因?yàn)闃悠肥前错樞蛑瘘c(diǎn)掃描成像的翻诉，這將是對(duì)更大的神經(jīng)元回路活動(dòng)進(jìn)行成像的一個(gè)基本障礙炮姨。有各種掃描方法可用于改善速度，比如XY掃描振鏡 (< 10 fps) 或者是共振掃描器 (> 30 fps) 以及Z軸掃描的壓電控制物鏡米丘。
對(duì)于高速的3D體積成像剑令，使用SLM液晶空間光調(diào)制器可以將光束分割成不同的目標(biāo)神經(jīng)元，同時(shí)可激發(fā)多個(gè)3D位點(diǎn)的神經(jīng)元拄查，實(shí)現(xiàn)多焦點(diǎn)在不同平面中同時(shí)快速切換吁津，比如使用Meadowlark的1024x1024空間光調(diào)制器可以在近紅外波段切換速度可以達(dá)到數(shù)百赫茲，在可見光波長實(shí)現(xiàn)1K Hz的幀率堕扶。同時(shí)也可用于實(shí)現(xiàn)光束復(fù)用和自適應(yīng)光學(xué)碍脏，產(chǎn)生與散射組織或者光學(xué)元件共軛的波前，從而減少來自光學(xué)器件和樣品的光束畸變稍算。
圖3. Meadowlark純相位液晶空間光調(diào)制器生成的11x11點(diǎn)陣圖
圖4. 使用SLM生成貝塞爾光束
圖5. Lu, R., Sun, W., Liang, Y., Kerlin, A., Bierfeld, J., Seelig, J. D., ... & Koyama, M. (2017). Video-rate volumetric unctional imaging of the brain at synaptic resolution. Nature neuroscience, 20(4), 620
四典尾、雙光子應(yīng)用對(duì)液晶空間光調(diào)制器的要求
1. 高液晶響應(yīng)速度 （<1ms），高刷新速度 （1436Hz）
Meadowlark公司 新推出的高刷新頻率LCoS SLM非常適用于雙光子成像糊探，這也是目前市面上能夠提供z快刷新幀率的商用液晶空間光調(diào)制器钾埂。它能實(shí)現(xiàn)在1064nm大于294.1Hz的純相位調(diào)制，將相位不穩(wěn)定性抑制到前所未有的0.2-1.0%科平。Meadowlark在設(shè)計(jì)1024 x 1024硅背板時(shí)非常謹(jǐn)慎褥紫，以實(shí)現(xiàn)高速運(yùn)行，同時(shí)z大程度地提高相位穩(wěn)定性瞪慧。1024 x 1024 SLM的速度令人難以置信髓考，在典型的室溫環(huán)境中運(yùn)行時(shí)，液晶響應(yīng)時(shí)間為0.9至8毫秒（取決于波長）弃酌，可實(shí)現(xiàn)全波調(diào)制氨菇。
2. 大通光面，可承受更高的激光功率（17.40 x 17.40 mm）
對(duì)于光遺傳學(xué)妓湘，許多研究人員適用飛秒脈沖激光器查蓉，這需要SLM能夠承受GW/mm2的峰值功率密度。Meadowlark 在900-1100nm 可以提供鍍介質(zhì)鏡版本的SLM多柑，這大大增加了SLM的損傷閾值奶是，使得能承受更大的激光功率，并得到更好的熒光激發(fā)強(qiáng)度竣灌。
3. 高衍射效率（Up to 98%）
Meadowlark將分辨率做到了1024x1024像素聂沙，對(duì)于光遺傳學(xué)來說，這可以將入射光分為多個(gè)焦點(diǎn)初嘹，并對(duì)不同深度進(jìn)行聚焦成像及汉。1024×1024 空間光調(diào)制器可以提供普通版本（97.2%填充因子）和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到100%屯烦，一級(jí)衍射效率可以做到98%坷随。
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