諸如可變形反射鏡，液晶空間光調(diào)制器（SLM）和柔性聚焦透鏡之類的波前成形裝置在顯微成像領(lǐng)域被廣泛的用于像差校正撮躁，體積成
像和可編程神經(jīng)元激發(fā)漱病。 其中液晶空間光調(diào)制器(SLM)是高分辨率的相位調(diào)制器把曼，能夠創(chuàng)建復(fù)雜的相位圖杨帽，以在三維（3D）體積內(nèi)可
實現(xiàn)任意的光束偏轉(zhuǎn)嗤军，可實現(xiàn)三維（3D）體積重塑。
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摘要
諸如可變形反射鏡浪慌，液晶空間光調(diào)制器（SLM）和柔性聚焦透鏡之類的波前成形裝置在顯微成像領(lǐng)域被廣泛的用于像差校正，體積成像和可編程神經(jīng)元激發(fā)朴则。 其中液晶空間光調(diào)制器(SLM)是高分辨率的相位調(diào)制器，能夠創(chuàng)建復(fù)雜的相位圖乌妒，以在三維（3D）體積內(nèi)可實現(xiàn)任意的光束偏轉(zhuǎn)汹想，可實現(xiàn)三維（3D）體積重塑撤蚊。
Meadowlark Optics（MLO）公司最新的SLM將面填充率從83.4％提高到96％，并將分辨率從512 x 512像素提高到1920 x 1152像素侦啸，同時在1064 nm處達到300 Hz的液晶響應(yīng)時間（0-2π）和845Hz的幀頻槽唾，可覆蓋波段：850-1650nm光涂。
本文總結(jié)了Meadowlark Optics公司新的SLM的功能庞萍，以及SLM在雙光子及三光子顯微微鏡成像應(yīng)用中的優(yōu)勢。
關(guān)鍵詞: 高響應(yīng)速度糙申，高分辨率，高效率，空間光調(diào)制器炼吴，LCOS, SLM ,液晶空間光調(diào)制器践付，雙光子顯微鏡缺厉，三光子顯微鏡
介紹：
在3D體積中監(jiān)控和操縱神經(jīng)元回路的發(fā)射模式的需求推動了用于神經(jīng)科學(xué)的高級雙光子顯微鏡的發(fā)展永高。掃描雙光子顯微鏡使用諧振(resonant stages)提针，或使用聲光偏轉(zhuǎn)器光柵掃描建立一個圖像。這種方式可實現(xiàn)50 kHz的掃描速率辐脖。然而饲宛，用這種方法難以實現(xiàn)同時多點刺激嗜价，因為激光需要停留在每個位置收集足夠的光子以產(chǎn)生可用的圖像或調(diào)節(jié)活動幕庐。試圖通過增加峰值激發(fā)強度來避免這種情況是基本上受到限制的，因為高功率激光會引起神經(jīng)元的光損傷和熒光團的光漂白家淤。此外异剥，傳統(tǒng)顯微鏡僅限于對二維表面進行成像絮重，而神經(jīng)回路具有三維結(jié)構(gòu)。深度掃描可用于構(gòu)建3D圖像青伤，但速度非常慢督怜，因為它通常通過以大約20 Hz的速率掃描物鏡來實現(xiàn)狠角。這不足以監(jiān)測在一毫秒的時間尺度上發(fā)生的神經(jīng)活動。對于光遺傳學(xué)研究丰歌，需要能夠在3D空間中動態(tài)和任意形成多個焦點的顯微鏡以監(jiān)視和操縱發(fā)射模式姨蟋，并且顯微鏡必須能夠進行3D成像以捕獲神經(jīng)元電路的響應(yīng)。
在掃描雙光子/三光子顯微鏡的激發(fā)路徑中添加液晶空間光調(diào)制器（SLM）芬探，可以將激發(fā)源分成幾百個獨立的焦點神得，并以高達300 Hz的頻率重新配置焦點的3D位置厘惦。因此哩簿，使用SLM可以傳遞光線，同時可激發(fā)多個3D位點的神經(jīng)元节榜，然后將目標(biāo)細胞定位在一個體積內(nèi)以監(jiān)測神經(jīng)回路對刺激的反應(yīng)羡玛。這使得在大量細胞群中監(jiān)測和操縱神經(jīng)元活動的過程可同步進行宗苍。 Yuste首次證明了SLM在光遺傳學(xué)中的應(yīng)用潛力，它開發(fā)了一種基于SLM的原型顯微鏡讳窟，可以同時激發(fā)腦切片中的多個神經(jīng)元让歼。在那項工作中，Yuste同時在幾十個神經(jīng)元中成像并檢測動作電位谋右，幀頻為66 Hz。這對于神經(jīng)科學(xué)界來說是一個重大進步补箍，但是當(dāng)時Yuste可用的SLM限制了這項工作啸蜜。
這項工作推動了先進的SLMs的發(fā)展，以提高分辨率以最大化可研究的大腦的體積辈挂，改善功率處理以增加一次可照亮的神經(jīng)元的數(shù)量，并且提高液晶的響應(yīng)時間呢岗，使得激勵時間可以匹配神經(jīng)電路動態(tài)過程冕香。Meadowlark Optics（MLO）公司最新的HSP1920型SLM分辨率從512 x 512像素提高到1920 x 1152像素后豫，同時在1064 nm處達到300 Hz的液晶響應(yīng)時間（0-2π）和845Hz的幀頻悉尾。
橫向/軸向激發(fā)
為了使SLM激發(fā)一定體積內(nèi)的神經(jīng)元挫酿，使用SLM作為成像的振幅調(diào)制器是不夠的。相反早龟，必須將SLM用作相位調(diào)制器惫霸，并且將所需激勵模式的傅立葉變換的全息圖寫入SLM葱弟。使用過渡鏡壹店，使SLM成像到物鏡的后焦平面芝加。為了利用物鏡的全數(shù)值孔徑（NA），同時不犧牲激發(fā)的限制藏杖，物鏡處的SLM的圖像應(yīng)該填充后孔将塑。目標(biāo)SLM圖像中像素間距的大序螋铩（稱為有效像素間距）取決于中繼光學(xué)系統(tǒng)（如下圖）点寥。
激發(fā)的橫向視場由可寫入SLM的最小相位光柵控制来吩。根據(jù)光柵方程sin（θ）= m *λ/ d，可以計算出光線可以偏轉(zhuǎn)的最大角度弟疆。這取決于設(shè)定的階數(shù)m戚长，波長λ和光柵d的周期兽间，其最小值為有效像素間距的2倍历葛。通過物鏡的焦距將測向角度轉(zhuǎn)換為樣品的橫向位移。下圖為用1920x1152液晶空間光調(diào)制器在1064nm實現(xiàn)了0度乓诽，0.2度，0.4度咒程，0.8度鸠天，1.6度的光束偏轉(zhuǎn)帐姻。
通過將SLM的分辨率從512 x 512提高到1920 x 1152像素，消除了激勵約束與視場之間的限制饥瓷。對于光遺傳學(xué)來說剥纷，希望維持x和y中激發(fā)的點擴散函數(shù)（PSF）呢铆，因此將SLM的正方形感興趣區(qū)域成像到物鏡的后焦平面晦鞋，有效地將SLM分辨率降低到1152×1152像素棺克。 SLM的像素間距為9.2微米，使得SLM的短軸為10.6毫米。為了使SLM圖像的尺寸與物鏡的后孔徑相匹配，中繼光學(xué)器件必須將SLM的圖像放大亚隙，從而將有效像素間距減小到8μm。在0猴贰，π衍射圖中，最大光柵周期為2個像素，入射波長為940 nm撑帖，SLM可以轉(zhuǎn)向的最大角度為3.36°蓉坎。取物鏡焦距為7.2 mm澳眷，最大橫向位移為零點附近±423μm，或x和y的總橫向位移為847μm蛉艾。這超出了目標(biāo)可以成像的視野，同時保持目標(biāo)的全部NA勿侯，因此不會犧牲激勵約束拓瞪。此外，通過傅里葉變換助琐，現(xiàn)在可以在樣本上創(chuàng)建1152 x 1152個焦點祭埂，這只能將目標(biāo)可解析的焦點利用不到1.16倍。
表1總結(jié)了1920 x 1152像素SLM和512 x 512像素SLM的客觀規(guī)格，光學(xué)系統(tǒng)蛆橡，側(cè)向光束傳輸規(guī)格，其中SLM的圖像與SLM的圖像與目標(biāo)后光圈的尺寸以及客觀利用率相匹配泰演。 可以使用概述的方程針對不同的SLM模型復(fù)制分析呻拌。
表1. SLM分辨率與客觀規(guī)格，中繼光學(xué)系統(tǒng)的選擇以及波長相結(jié)合睦焕，決定了SLM可以使光線轉(zhuǎn)向的橫向視場的規(guī)格藐握。 該表比較了當(dāng)將SLM的圖像與物鏡的后孔徑相匹配時的512×512像素SLM，當(dāng)將SLM的圖像填充到物鏡上以犧牲激勵約束以匹配轉(zhuǎn)向指向的視場時 目標(biāo)垃喊，1920 x 1152 1152 x 1152像素圖像中繼到目標(biāo)猾普。 高分辨率SLM將SLM的射束導(dǎo)向能力與目標(biāo)視野相匹配本谜，而不會犧牲激勵約束抬闷。
表2總結(jié)了光學(xué)系統(tǒng)，1920 x 1152像素SLM和512 x 512像素SLM的光學(xué)系統(tǒng)耕突，軸向光束轉(zhuǎn)向規(guī)格笤成，其中SLM的圖像與物鏡后孔徑的尺寸相匹配眷茁。
表2. SLM分辨率加上客觀規(guī)格炕泳，中繼光學(xué)元件的選擇和波長決定了焦距從客觀設(shè)計焦距的最大軸向位移的規(guī)格。 該表比較了當(dāng)將SLM的圖像與物鏡的后孔相匹配時的512×512像素SLM上祈，當(dāng)SLM在物鏡上的圖像填充不足時，以及1920×1152登刺，其中1152×1152像素圖像是 轉(zhuǎn)達到目標(biāo)籽腕。
損傷閾值
隨著激勵視野的增加，可以研究更多的神經(jīng)元和更大的神經(jīng)回路纸俭。為了照亮視野中的多個物體皇耗，SLM將入射照明分為多個焦點。隨著焦點數(shù)量的增加揍很，每個焦點的功率下降郎楼。為了增加激發(fā)目標(biāo)的數(shù)量，同時保持每個目標(biāo)足夠的功率以激發(fā)熒光呜袁，SLM的功率處理變得至關(guān)重要。多個因素影響功率處理简珠。增加SLM的尺寸允許照明分布在更大的區(qū)域阶界，涂層可以被優(yōu)化以限制吸收，并且主動和被動冷卻系統(tǒng)可以用于緩解熱效應(yīng)。
對于光遺傳學(xué)膘融，許多研究人員正在使用飛秒脈沖激光器芜抒。 Coherent Monaco是一款1035 nm脈沖激光器，可編程脈沖寬度范圍從300飛秒（FWHM托启，sech2 fit）到10皮秒。它具有40 uJ的最大脈沖能量屯耸，并且在1 MHz的脈沖重復(fù)頻率下拐迁，激光器可輸出40 W的平均功率。通過將入射光功率從101 MW / cm2增加到729 MW / cm2對1920 x 1152 SLM（型號：HSP1920-1064-HSP8）的損傷閾值進行測試疗绣，同時在向SLM寫入一系列衍射圖時測量背板溫度和一階衍射效率线召。當(dāng)使用被動冷卻系統(tǒng)時，由于隨著入射功率增加多矮，背板溫度增加22°C缓淹，觀察到調(diào)制深度的變化塔逃。然而讯壶，在最大入射功率下，調(diào)制深度仍然大于一個波湾盗，允許基于溫度表征光學(xué)響應(yīng)的能力伏蚊，并且使用片上傳感器作為閉環(huán)系統(tǒng)來保持與入射功率無關(guān)的一階衍射效率格粪□锏酰或者，可以將有源冷卻塊添加到SLM帐萎，以維持低于40°C的工作溫度比伏，從而保持一致的調(diào)制深度而與入射功率無關(guān)疆导。
激光參數(shù)：1MHz重復(fù)頻率赁项，280 fs脈沖寬度，6.7mm光束尺寸（1 / e2）是鬼。 最大輸出功率36uJ紫新，平均功率36W均蜜，平均功率密度= 204W / cm2，峰值功率= 128MW芒率，峰值功率密度= 729MW / cm2囤耳。 （左）由于被動冷卻系統(tǒng)的熱效應(yīng)，入射功率增加時調(diào)制深度減小（右）增加主動冷卻系統(tǒng)允許在峰值功率密度高達729MW / cm2的情況下保持一致的調(diào)制深度充择。
響應(yīng)時間
液晶響應(yīng)時間取決于多個因素德玫，包括液晶層的厚度，其被優(yōu)化后在最長工作波長處提供一個相位行程波宰僧，驅(qū)動器的電壓和液晶材料特性。 對于光遺傳學(xué)观挎，大多數(shù)研究人員將SLM與雙光子琴儿、三光子顯微鏡結(jié)合，并且工作在900 nm至1300 nm的波長范圍內(nèi)嘁捷。 MLO是唯一提供高速SLM的供應(yīng)商造成，HSP1920-1064型液晶空間光調(diào)制器在1064 nm，能夠達到300 Hz的液晶響應(yīng)速度(從0 - 2pi轉(zhuǎn)換)和845Hz的幀頻（灰度圖片同電腦傳輸?shù)?/span>SLM速度）雄嚣。
在1064 nm處晒屎，液晶從10%到90%范圍內(nèi)上升和下降時間小于3 ms缓升。將焦點通過觸發(fā)打開和觸發(fā)關(guān)閉進行檢測鼓鲁。 （左）由軟件定時驅(qū)動的液晶開關(guān)。 焦點被打開和關(guān)閉探測器（顯示為黃色）港谊。 當(dāng)SLM上的圖像發(fā)生變化時，硬件會產(chǎn)生一個輸出脈沖（以紫色顯示）封锉，表示新圖像將在1.18 ms內(nèi)開始在SLM上加載绵跷。 （右）由外部硬件觸發(fā)驅(qū)動的液晶開關(guān)。 當(dāng)外部觸發(fā)器的下降沿到達（以藍色顯示）時成福，硬件將啟動SLM上的圖像更新碾局。 產(chǎn)生輸出脈沖以確認接收到觸發(fā)（以紫色顯示）。 在產(chǎn)生輸出脈沖后的1.18面試內(nèi)奴艾，圖像將在SLM上更新（以黃色顯示净当，焦點移入和移出檢測器）。
相位穩(wěn)定性
為了確保激勵源在許多神經(jīng)元之間分配時的一致激勵蕴潦，SLM的時間特性變得重要。 MLO SLM使用兩種策略來最大化相位穩(wěn)定性潭苞。第一種策略是使用直接模擬尋址忽冻，而不是模擬使用二進制尋址與時序抖動相結(jié)合的模擬調(diào)制。第二種策略是使用能夠以844Hz的速率刷新的定制背板此疹。高速背板刷新對于減輕像素電容的電壓損失是必要的僧诚。如果背板刷新較慢遮婶，則像素處的電壓下降使液晶分子松弛，從而改變LC的折射率湖笨。如果背板電壓的刷新速度明顯快于LC弛豫時間旗扑，那么SLM將具有較高的相位穩(wěn)定性慈省。
通過向SLM寫入重復(fù)相位斜坡并測量一階強度來量化相穩(wěn)定性臀防。 LC分子松弛的不穩(wěn)定性會導(dǎo)致一階焦點的強度隨時間而變化。相穩(wěn)定性被定義為峰到一階焦點強度的峰值與平均焦點強度的比值边败。對于具有ODP的512 x 512像素SLM，相位紋波為3％ - 5％放闺，對于高速1920 x 1152像素SLM祟昭，相位紋波為2％ - 4％（圖6）。對于需要更高相位穩(wěn)定性和高分辨率的研究怖侦，標(biāo)準(zhǔn)的1920 x 1152像素SLM可提供低至0.20％的相位紋波篡悟。
波前質(zhì)量（波前畸變）
單光子激發(fā)相比，雙光子激發(fā)具有更好的限制匾寝，因為由兩個光子同時激發(fā)的可能性與光強度的平方成正比搬葬。因此，雙光子激發(fā)以焦點距離的四次冪衰減[8]艳悔。然而，這種低激發(fā)的可能性使得操作模式對改變焦點的PSF的像差敏感猜年。為了確保在大體積上的一致激發(fā)抡锈，校正顯微鏡中SLM和其余光學(xué)元件的像差是很重要的。
許多用于表征和校正像差的算法都基于Zernike多項式乔外。然而床三，對圓形孔徑的依賴不適用于描述正方形或矩形陣列的像差。已經(jīng)開發(fā)了基于SLM的干涉子孔徑的替代策略[9]杨幼，以確保SLM的有效區(qū)域上的像差可以被校正到λ/ 40或更好撇簿。如圖7所示差购，由于使用了制造工藝四瘫，MLO SLM的本地波前像差很低。殘留誤差被去除以確保神經(jīng)元激發(fā)的衍射受限焦點欲逃。
（a）原始的1920 x 1152像素SLM波前（λ/ 7 RMS）（b）應(yīng)用了像差校正的波前（λ/ 20 RMS）
（c）未應(yīng)用校正的像差曲面圖找蜜。 （c）應(yīng)用校正后的像差曲面圖暖夭。
神經(jīng)元激發(fā)效率
光遺傳學(xué)的目標(biāo)是了解神經(jīng)回路的功能锹杈，以及發(fā)射模式和行為之間的關(guān)系撵孤。為了獲得成功迈着，科學(xué)家需要能夠監(jiān)測和操縱盡可能多的神經(jīng)元，并以與自然發(fā)生的電路動力學(xué)相匹配的速率復(fù)制發(fā)射模式裕菠。有許多因素決定每秒可處理多少神經(jīng)元咬清，其中一些取決于實驗，另一些取決于光學(xué)系統(tǒng)的極限奴潘。例如旧烧，當(dāng)針對皮質(zhì)深處的神經(jīng)元時，由于散射造成的損失是顯著的画髓。由于存在激光功率會導(dǎo)致熱損傷的閾值掘剪，因此不能簡單地增加入射功率以適應(yīng)散射損失。在這種情況下奈虾，皮層所需層的有限功率將決定可被激發(fā)的神經(jīng)元的數(shù)量。然而肉微，假設(shè)一位研究人員試圖將神經(jīng)元定位在皮層的相同位置，SLM的規(guī)格也將決定每秒可以定位的神經(jīng)元的數(shù)量。HSP1920-1064空間光調(diào)制器較原來的ODP512SLM在神經(jīng)元激活的速度方面提高了將近一倍丰榴。
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