博覽：2019Nature Photonics厘米尺度和微米分辨率的生物動(dòng)力學(xué)視頻幀率成像

正文

厘米尺度和微米分辨率的生物動(dòng)力學(xué)視頻幀率成像

技術(shù)背景：

鑒于生命系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)和復(fù)雜特性，幾乎不可能憑借極小的局部區(qū)域的特征來(lái)預(yù)測(cè)系統(tǒng)性行為台猴。要研究系統(tǒng)的生物學(xué)特性朽合，例如跨皮質(zhì)區(qū)域的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)、白細(xì)胞運(yùn)輸動(dòng)態(tài)或腫瘤轉(zhuǎn)移饱狂，需要一臺(tái)至少具有毫米級(jí)視場(chǎng)和亞細(xì)胞分辨率的顯微鏡以視頻幀率來(lái)記錄動(dòng)態(tài)的生物活動(dòng)曹步。這需要具有高空間帶寬積(分辨率X視場(chǎng)）的光學(xué)系統(tǒng)和具有高數(shù)據(jù)吞吐量(像素?cái)?shù)X幀率)的采集系統(tǒng)。最近發(fā)明的Mesolens顯微鏡休讳，已經(jīng)展示出大視場(chǎng)下高分辨率成像能力讲婚。在共聚焦掃描模式下，Mesolens 可以從毫米級(jí)樣本中收集大量信息俊柔，并已用于對(duì)整個(gè)固定的 12.5 天大的完整小鼠胚胎進(jìn)行成像筹麸。

光學(xué)系統(tǒng)與尺度相關(guān)(scale-dependent)的幾何像差從根本上限制了顯微鏡的 空間帶寬積，使得可實(shí)現(xiàn)的分辨率和視場(chǎng)是一對(duì)矛盾量雏婶。當(dāng)前有兩種方法可以繞過(guò)這個(gè)難題：（1）圖像拼接物赶，大尺度的樣本通過(guò)逐個(gè)小區(qū)域掃描完成整體采集；(2) 傅里葉疊層成像留晚，使用大視場(chǎng)酵紫、低分辨率成像系統(tǒng)，通過(guò)采集大量不同照明條件下的大視場(chǎng)低分辨率圖像错维，在傅里葉域進(jìn)行后處理獲得最終圖像憨闰。不幸的是，它們?cè)诟叻直媛氏碌男阅艽鷥r(jià)是犧牲了時(shí)間分辨率需五。例如鹉动，在傅立葉疊層顯微鏡中獲得十億像素圖像需要大約 3 分鐘。這些技術(shù)的數(shù)據(jù)吞吐量遠(yuǎn)不足以支持單次宏邮、全視場(chǎng)信息采集泽示。此外缸血，在這兩種情況下，整個(gè)視場(chǎng)成像的全過(guò)程中樣本都需要保持靜止械筛，這在活體成像中是很難實(shí)現(xiàn)的捎泻，對(duì)清醒、活動(dòng)的動(dòng)物成像時(shí)更甚埋哟。當(dāng)需要高速成像時(shí)笆豁，必須選擇感興趣的小區(qū)域。因此赤赊，它們不可能用于生物動(dòng)力學(xué)的大尺度成像闯狱。對(duì)于高空間帶寬積天文學(xué)，已經(jīng)提出了非平面成像表面的望遠(yuǎn)鏡抛计，成功地減輕了設(shè)計(jì)和制造方面的挑戰(zhàn)哄孤。

當(dāng)前不足：

對(duì)于系統(tǒng)生物學(xué)中非常需要的動(dòng)態(tài)成像，Mesolens顯微鏡數(shù)據(jù)吞吐量有限吹截。例如瘦陈，在具有亞細(xì)胞分辨率的哺乳動(dòng)物皮層全腦功能成像中，以視頻速率(>10 fps用于鈣成像)采集波俄，成像系統(tǒng)應(yīng)具有 ~10 mm × 10 mm 視場(chǎng)晨逝，~1 μm 分辨率，相應(yīng)的數(shù)據(jù)吞吐量應(yīng)大于每秒 4 gigapixels懦铺。在19年本文發(fā)表前捉貌，這樣的系統(tǒng)還未出現(xiàn)。

非平面成像表面的望遠(yuǎn)鏡設(shè)計(jì)是鼓舞人心的阀趴，但將這樣的策略從望遠(yuǎn)鏡轉(zhuǎn)向顯微鏡并非易事昏翰。

文章創(chuàng)新點(diǎn)：

基于此，清華大學(xué)的Jingtao Fan(第一作者)和Qionghai Dai(通訊作者)提出了一種實(shí)時(shí)刘急、超大尺度棚菊、高分辨率成像的宏觀顯微鏡(macroscope)，它實(shí)現(xiàn)了厘米級(jí)尺度(10mmX12mm)和微米級(jí)分辨率(525nm時(shí)橫向分辨率0.92um)的生物動(dòng)力學(xué)視頻速率(30fps)叔汁、十億像素(gigapixel)成像统求，數(shù)據(jù)吞吐量高達(dá) 5.1 gigapixels/秒。

（1）物鏡采取平面-曲面的成像策略据块，設(shè)計(jì)全新的顯微物鏡成像光路码邻，實(shí)現(xiàn)物鏡將物方大視場(chǎng)的平面與像方的凹形中間像面對(duì)應(yīng)，從而極大的減小幾何像差(特別是場(chǎng)曲)另假。

（2）采集單元鏡頭采取曲面-平面的成像策略像屋，受昆蟲(chóng)復(fù)眼的啟發(fā)，凹形中間像面被分成35個(gè)小視場(chǎng)边篮，并被35個(gè)中繼鏡頭組(采集單元)重新成像到平面scmos上己莺，scmos水冷處理至10℃奏甫，保持低噪聲水平。

原理解析：

（1）降低幾何像差凌受，放大中間像面阵子。當(dāng)視場(chǎng)和數(shù)值孔徑變大時(shí)，場(chǎng)曲和其它幾何像差會(huì)迅速增加胜蛉。獲得均勻分辨率的大的平面像需要極度復(fù)雜的光學(xué)設(shè)計(jì)挠进，實(shí)現(xiàn)起來(lái)很困難。采用曲面像面設(shè)計(jì)策略誊册，可以極大的減小如場(chǎng)曲這樣的幾何像差领突。如圖1a，設(shè)計(jì)一個(gè)14片的物鏡(直徑161mm解虱，長(zhǎng)280mm攘须，0.35NA 漆撞，使用Zemax設(shè)計(jì))殴泰，成半徑為1.9m的凹面中間像面以與場(chǎng)曲適配。如此大的半徑的曲面浮驳，便于下一步的子視場(chǎng)分割及并行采集悍汛。

（2）子視場(chǎng)分割，并行采集至会。將凹面視場(chǎng)分成35個(gè)子視場(chǎng)离咐，用35個(gè)中繼鏡頭組并行采集，每個(gè)子視場(chǎng)的主光線垂直于中間像面奉件，相鄰子視場(chǎng)重疊率為3.6%宵蛀，如圖1a。

（3）校準(zhǔn)和裝配县貌。采取快速計(jì)算在環(huán)(computation-in-loop)的校準(zhǔn)策略术陶，獲得亞像素的校準(zhǔn)精度，并提供用于組裝相機(jī)陣列所需要的反饋煤痕。如圖2梧宫，第一步：使用高密度的LCD模組(500PPI)上不同單元的時(shí)分編碼來(lái)設(shè)置全局物理坐標(biāo)，具體來(lái)說(shuō)摆碉，12-bit時(shí)間編碼分別用于x和y坐標(biāo)塘匣；第二步：每一個(gè)子視場(chǎng)相機(jī)采集LCD上一個(gè)特定小區(qū)域的圖像序列，因此每個(gè)LCD單元上相應(yīng)的全局位置可以通過(guò)時(shí)間模式編碼巷帝；第三步：對(duì)每個(gè)子視場(chǎng)圖像里的LCD單元忌卤，使用面積中心(centre-of-area)方法(包含二值化和權(quán)重平均)進(jìn)一步提取精確的局部圖像坐標(biāo)；第四步：獲得所有子視場(chǎng)的局部和全局坐標(biāo)后楞泼，建立一組單應(yīng)矩陣(homographic matrices){Hi}用于無(wú)縫連續(xù)拼接驰徊。

（4）采集历谍，存儲(chǔ)和無(wú)縫拼接。設(shè)計(jì)一個(gè)九節(jié)點(diǎn)的計(jì)算機(jī)集群來(lái)適應(yīng)傳輸辣垒、存儲(chǔ)和處理所需的巨大帶寬(見(jiàn)圖3)望侈。通過(guò)這種設(shè)置，35 張圖像（每張 5.5 百萬(wàn)像素）被同步連續(xù)捕獲勋桶，最大幀率高達(dá) 30fps脱衙。捕獲的數(shù)據(jù)通過(guò)雙攝像頭鏈接傳輸?shù)?a style="color: blue" href="http://www.wjjzl.com/product_foxpro_10.html" target="_blank">光纜。在35線雙工光網(wǎng)絡(luò)(35-cable duplexing optical networks)中例驹，圖像傳輸帶寬達(dá)到每秒5.1 千兆像素捐韩，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)帶有 324 個(gè)硬盤(pán)（每個(gè) 4TB）的分布式文件系統(tǒng)。該分布式文件系統(tǒng)用于調(diào)度本地?cái)?shù)據(jù)寫(xiě)入請(qǐng)求到每個(gè)節(jié)點(diǎn)鹃锈，并使用元數(shù)據(jù)集群機(jī)制提供跨節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)交換能力荤胁，促進(jìn)了高度并行且粒度(granularity)可調(diào)的分布式拼接算法。因此屎债，可以根據(jù)感興趣的區(qū)域?qū)崿F(xiàn)自適應(yīng)分辨率調(diào)整的實(shí)時(shí)在線拼接仅政，并且可以以高達(dá) 1.1 fps 的速度對(duì)整個(gè)十億像素視頻進(jìn)行拼接和離線存儲(chǔ)。

視頻1：清醒小鼠血管和鈣信號(hào)的成像

視頻2：小鼠神經(jīng)活動(dòng)的鈣成像

附錄：

參考文獻(xiàn)：Fan, J., Suo, J., Wu, J. et al. Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution. Nat. Photonics 13, 809–816 (2019).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41566-019-0474-7

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