時間分辨熒光光譜是基礎(chǔ)物理和生命科學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)大的分析工具需频，目前大部分是一些有物理背景的科研人員在做這方面的研究，期待不久的將來能催生時間分辨熒光光譜在生命科學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用筷凤。
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時間相關(guān)單光子計數(shù)原理
在時域范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)時間分辨熒光光譜需要記錄激光脈沖激發(fā)后發(fā)射光隨時間變化的強(qiáng)度分布昭殉。理論上可以記錄單個激發(fā)-發(fā)射循環(huán)的信號的時間衰減曲線，但在實(shí)際應(yīng)用中還存在著許多問題藐守。首先挪丢，要記錄的時間衰減非常快卢厂，比如普遍使用的有機(jī)熒光團(tuán)的光致發(fā)光過程僅持續(xù)幾百皮秒到幾十納秒乾蓬；另外不僅要獲取熒光壽命，還要還原熒光衰減曲線形狀慎恒，通常為了解決多指數(shù)衰減任内，必須能夠在時間上將記錄的信號解析到這樣的程度：由幾十個樣品進(jìn)行衰減。
使用普通的電子瞬態(tài)記錄儀很難達(dá)到所需的時間分辨率融柬。 另外如果發(fā)射的光太弱則無法產(chǎn)生代表光通量的模擬電壓死嗦。 實(shí)際上光信號可能只有每個激發(fā)/發(fā)射周期的幾個光子。 然后信號本身的離散特性導(dǎo)致無法進(jìn)行模擬采樣粒氧。 即使可以通過增加激發(fā)功率來獲得更多熒光越除，也會存在限制，例如外盯，由于收集光學(xué)損耗廊敌、檢測器靈敏度的光譜限制或在更高激發(fā)功率下的光漂白。Z終门怪，當(dāng)觀察到的樣品僅由幾個甚至單個分子組成時骡澈，就會出現(xiàn)問題。
使用時間相關(guān)單光子計數(shù)（tcspc）可以有效解決上述問題掷空。通過周期性激發(fā)可以將數(shù)據(jù)收集擴(kuò)展到多個激發(fā)和發(fā)射循環(huán)肋殴，因此可以從多個周期中收集到的單光子事件中重建單個周期的衰減曲線。
該方法基于對單個光子的重復(fù)坦弟、精確定時配準(zhǔn)护锤。 計時的參考是相應(yīng)的激發(fā)脈沖。 單光子靈敏探測器可以使用光電倍增管 (PMT)酿傍、微通道板 (MCP)或單光子雪崩二極管 (SPAD)烙懦。 假設(shè)每個周期記錄一個以上光子的概率很低，每個時間段光子到達(dá)形成的直方圖表示從單次時間分辨模擬記錄中獲得的時間衰減赤炒。 如有必要氯析，可以通過衰減樣品處的光來滿足單光子概率的前提條件亏较。
如上圖說明了如何在多個周期內(nèi)形成直方圖。激光脈沖反復(fù)激發(fā)產(chǎn)生光致發(fā)光掩缓。 激發(fā)和發(fā)射之間的時間差是由像秒表一樣的電子設(shè)備測量的雪情。 如果滿足單光子概率條件，實(shí)際上在許多周期中根本沒有光子你辣。應(yīng)該注意的是光子或空循環(huán)的出現(xiàn)完全是隨機(jī)的巡通，只能用概率來描述。 因此舍哄，這同樣適用于各個秒表讀數(shù)宴凉。
如上圖所示，秒表讀數(shù)被分成一個由一系列“時間段”組成的直方圖表悬。 時間段的寬度通常對應(yīng)于秒表的分辨率（幾皮秒）弥锄，但可以選擇更寬以覆蓋更長的總時間跨度。 時間分辨熒光實(shí)驗(yàn)的典型結(jié)果是一個直方圖签孔，隨著時間的推移叉讥，計數(shù)呈指數(shù)下降。對多個分子的單次激發(fā)實(shí)驗(yàn)中熒光強(qiáng)度呈指數(shù)下降可以解釋如下：假設(shè)從 1000 個激發(fā)分子開始饥追，設(shè)每個分子在D1個納秒內(nèi)返回基態(tài)的概率為50%图仓，在下一納秒的觀察中，又損失了 50%但绕，依此類推救崔，由于光的強(qiáng)度是由在任意時間段內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)量決定的，因此它與受激分子的存在數(shù)量成正比捏顺。
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