拉曼效應(yīng)最早是在20世紀(jì)20年代由拉曼C.V發(fā)現(xiàn)的。它是一種廣泛用于測(cè)定分子振動(dòng)模式的光譜方法构眯。與其他分析化學(xué)方法相比愕难，光譜
方法提供高空間分辨率，不需要直接接觸來(lái)獲取化學(xué)信息惫霸。振動(dòng)光譜提供了合理的化學(xué)特殊性猫缭，不需要額外的標(biāo)記物。而自發(fā)拉曼光譜
學(xué)是一個(gè)弱散射過(guò)程壹店。成像和顯微鏡的應(yīng)用猜丹，一個(gè)單一的視野可能要花費(fèi)數(shù)小時(shí)的信號(hào)積分時(shí)間。因此硅卢，相干拉曼散射方法射窒，如受激拉
曼散射效應(yīng), 現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于拉曼成像中。在本應(yīng)用中, 我們將描述Moku:Lab的鎖相放大器是如何在波士頓大學(xué)先進(jìn)的受激拉曼成像
裝置中實(shí)現(xiàn)的将塑。
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介紹
拉曼光譜法是一種非破壞性分析化學(xué)方法点寥。它直接探測(cè)樣品的振動(dòng)模式艾疟。與電子光譜法相比，拉曼光譜法無(wú)需熒光標(biāo)記即可提供高化學(xué)
特異性敢辩”卫常可以完全無(wú)接觸和無(wú)標(biāo)簽的方式測(cè)試樣品，從而防止對(duì)系統(tǒng)的干擾戚长。紅外光譜是獲得振動(dòng)光譜的另一種常用方法盗冷。紅外光譜和
拉曼光譜的選擇規(guī)則是不同的。紅外光譜對(duì)偶極子的變化很敏感历葛，而拉曼光譜對(duì)極化率的變化敏感正塌。這使得IR和拉曼成為用于特定化學(xué)
鍵組的良好工具。對(duì)于成像和顯微鏡應(yīng)用恤溶，在紅外或拉曼光譜之間進(jìn)行選擇時(shí)乓诽，還要考慮兩個(gè)其他重要因素：1）空間分辨率需求。紅
外光譜法使用紅外光作為光源咒程。拉曼可以使用可見(jiàn)光或近紅外（NIR）激光器進(jìn)行激發(fā)鸠天。由于可見(jiàn)光或NIR激光的波長(zhǎng)要很短，因此拉
曼顯微鏡的空間分辨率可以達(dá)到亞微米范圍帐姻。另一方面稠集，IR光具有幾微米的波長(zhǎng)。對(duì)于許多顯微鏡應(yīng)用來(lái)說(shuō)饥瓷，空間分辨率被認(rèn)為是差
的剥纷。 2）水在紅外區(qū)域具有很強(qiáng)的吸收能力。對(duì)于富含水的環(huán)境（例如生物樣品）呢铆，IR可能遭受強(qiáng)烈的吸收晦鞋，因此在某些情況下首選拉
曼。
與占主導(dǎo)地位的瑞利散射相比棺克，拉曼散射非常弱悠垛。 為了獲得合理的信噪比，通常需要幾秒鐘的長(zhǎng)積分時(shí)間娜谊。 對(duì)于常規(guī)光譜來(lái)說(shuō)确买，這可
能不是問(wèn)題，但是對(duì)于光譜成像而言纱皆，可能需要幾個(gè)小時(shí)才能獲得一個(gè)單一的視野湾趾。為了增強(qiáng)信號(hào)，這些年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種不同的方
法抹剩〕盘基于等離激元的方法，例如表面增強(qiáng)拉曼光譜澳眷，進(jìn)一步將檢測(cè)極限降低到單分子水平胡嘿。相反，納米顆粒誘導(dǎo)的不均勻性使其難以成
像钳踊。 對(duì)于成像科學(xué)家來(lái)說(shuō)衷敌，更有前景的方法是增強(qiáng)非線(xiàn)性光學(xué)的相干拉曼散射方法：受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散
射（CARS）。
相干拉曼效應(yīng)最早是在1960年代發(fā)現(xiàn)的拓瞪。在1990和2000年代末缴罗，由于超快鎖模激光器的進(jìn)步，謝尼（Sunney Xie）及其同事率先將
CARS9和SRS10用于無(wú)標(biāo)記化學(xué)顯微鏡祭埂。從那時(shí)起面氓，這些技術(shù)已廣泛用于化學(xué)兵钮，生物學(xué)和材料科學(xué)研究。 CARS和SRS有很多相似之
處。這些非線(xiàn)性光學(xué)過(guò)程通常在相同條件下發(fā)生，并且儀器設(shè)置幾乎相同芒炼。但是兴蒸，有一些差異。就像自發(fā)的拉曼一樣，CARS信號(hào)（圖
1中的ω為反斯托克斯）與入射光束（ωp，泵浦，ωs斯托克斯）的波長(zhǎng)不同靴拱，使用短通濾波器很容易將信號(hào)從入射光中分離出來(lái)。
到達(dá)檢測(cè)器的光子總量很小猾普，因此使用更靈敏的光子檢測(cè)器（例如光電倍增管（PMT））進(jìn)行檢測(cè)袜炕。但是，CARS受其他非共振非線(xiàn)性
光學(xué)效應(yīng)所產(chǎn)生的背景的影響初家。 這些影響不僅限制了CARS測(cè)量的實(shí)際檢測(cè)極限妇蛀，而且使光譜失真（與分子振動(dòng)共振相比）。 另一方
面笤成，SRS信號(hào)不受大多數(shù)其他非線(xiàn)性光學(xué)效應(yīng)的干擾评架。 但是，SRS是受激發(fā)射過(guò)程炕泳。 信號(hào)以入射光相同的波長(zhǎng)發(fā)生纵诞。 SRS效應(yīng)僅略微
增加/減少了斯托克斯束和泵浦束的光子數(shù)量。 這些變化很小培遵，以至于無(wú)法通過(guò)常規(guī)的時(shí)域測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量浙芙。 因此，SRS需要具有鎖
相檢測(cè)功能的光泵浦探測(cè)技術(shù)籽腕。
光學(xué)泵浦探測(cè)技術(shù)和鎖定檢測(cè)：
泵浦探針?lè)ㄊ怯糜诙喙庾訖z測(cè)過(guò)程的一種普遍采用的方法嗡呼。該實(shí)驗(yàn)通常涉及兩束超快(皮秒或飛秒)激光束，一束光一直照, 而第二束光
束以恒定頻率進(jìn)行AM調(diào)制皇耗。因此南窗，由第二束引起的變化或擾動(dòng)都會(huì)以調(diào)制頻率被傳遞到第一束。在探測(cè)器上, 用一個(gè)光學(xué)濾波器來(lái)阻
擋已調(diào)制的光束郎楼。僅檢測(cè)到未調(diào)制的波長(zhǎng)万伤。作為信號(hào)僅發(fā)生在調(diào)制頻率附近，通常使用鎖相放大器（LIA）來(lái)放大信號(hào)呜袁。鎖相放大器使
用零差檢測(cè)方法敌买，將輸入信號(hào)與正弦波本振混合在一起再調(diào)制頻率。隨后阶界，它通過(guò)低通濾波器和電壓放大器（可選）發(fā)送信號(hào)虹钮，并輸出
到數(shù)字化儀或示波器聋庵。這樣可以確保僅放大和檢測(cè)與調(diào)制頻率非常接近的信號(hào)。拒絕其他頻率的信號(hào)（例如激光重復(fù)頻率或DC 背
景）芙粱。這使得鎖相放大器成為檢測(cè)泵浦探頭的必不可少的工具珍策，可以在一下視頻中找到相關(guān)鎖相放大器的更多詳細(xì)說(shuō)明：
https://youtu：.be/H2O2ADqEkHM 和 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg.
特別是對(duì)于SRS，兩個(gè)光束（泵浦和斯托克斯）的能量差與目標(biāo)拉曼位移精確匹配宅倒。理論上, 泵浦或斯托克斯都可以調(diào)制，而另一束用
于檢測(cè)屯耸。如果對(duì)泵浦光束調(diào)制拐迁，則在泵浦光束處于開(kāi)啟狀態(tài)時(shí)，SRS過(guò)程會(huì)導(dǎo)致斯托克斯光束稍微增加疗绣。在檢測(cè)中线召，泵浦光束被阻擋
，僅斯托克斯光束被檢測(cè)到多矮。這被稱(chēng)為受激拉曼增益(SRG)檢測(cè)缓淹。如果斯托克斯束被調(diào)制，則在斯托克斯束接通的情況下塔逃，SRS過(guò)程會(huì)
導(dǎo)致泵浦光束略微減小讯壶。在探測(cè)器處，斯托克斯光束被阻擋湾盗，并且只有泵束被檢測(cè)到伏蚊。這稱(chēng)為受激拉曼損耗（SRL）檢測(cè)。對(duì)于本應(yīng)用
筆記中提供的示例用例格粪，由于將光檢測(cè)器針對(duì)泵浦波長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化躏吊，因此實(shí)施了SRL方案。
實(shí)驗(yàn)設(shè)置
激光
SRS的產(chǎn)生需要兩個(gè)超快激光脈沖在樣品上空間和時(shí)間上重疊帐萎。為了獲得穩(wěn)定的時(shí)間重疊比伏，當(dāng)今的SRS顯微鏡通常使用單個(gè)Ti：藍(lán)寶石
激光可產(chǎn)生泵浦光束和斯托克斯光束。皮秒和飛秒激光器均可用于SRS測(cè)量疆导。皮秒激光器提供了更精細(xì)的光譜輪廓赁项。無(wú)需額外的光學(xué)器
件即可實(shí)現(xiàn)高光譜分辨率。與自發(fā)拉曼光譜不同澈段，自發(fā)拉曼光譜可以用單色激光同時(shí)測(cè)量所有拉曼光譜肤舞，而受激拉曼光譜則需要進(jìn)行波
長(zhǎng)調(diào)整以測(cè)量其他光譜點(diǎn)，并且在獲取光譜圖像時(shí)調(diào)整激光波長(zhǎng)會(huì)限制測(cè)量速率均蜜。另一方面李剖，飛秒激光器本身具有廣譜《诙可以使用一種
稱(chēng)為“光譜聚焦”的技術(shù)來(lái)快速調(diào)整泵和斯托克斯束之間的能量差篙顺∨忌郑可以在更短的時(shí)間內(nèi)獲取光譜圖像。但是德玫，這種方法增加了系統(tǒng)的
光學(xué)復(fù)雜性匪蟀。需要在光束路徑中添加一對(duì)衍射光柵或高折射率材料（例如SF57玻璃棒），讓光譜范圍受到限制宰僧。有關(guān)頻譜聚焦方法的
詳細(xì)說(shuō)明可以在最近的出版物中找到材彪。
簡(jiǎn)而言之，如果一次關(guān)注單個(gè)拉曼位移琴儿，則皮秒激光的設(shè)置要簡(jiǎn)單得多段化。飛秒激光器是快速高光譜圖像采集的首選，但系統(tǒng)比較復(fù)雜
性造成。 Moku：Lab LIA可以與皮秒和飛秒激光器配對(duì)使用显熏。在本文中介紹的用例中，飛秒激光器（Spectra-physics Mai Tai）與SF57
玻璃棒一起用于光譜聚焦晒屎。
調(diào)制喘蟆，延遲階段和掃描：
泵浦和斯托克斯束通常由聲光調(diào)制器（AOM）或電光調(diào)制器（EOM）進(jìn)行調(diào)制。調(diào)制頻率通常在MHz范圍內(nèi)鼓鲁。這有助于減少由光熱
膨脹產(chǎn)生的背景并提高圖像采集速度蕴轨。在本應(yīng)用筆記中，泵浦光束是由AOM在2 MHz左右調(diào)制的骇吭。為了使泵浦和斯托克斯光束在時(shí)間
上保持一致尺棋，一個(gè)電動(dòng)的延遲用于調(diào)整任一或兩個(gè)光路驅(qū)動(dòng)器的光路長(zhǎng)度。
對(duì)于具有光譜聚焦的飛秒SRS绵跷，延遲級(jí)還用于微調(diào)泵浦和斯托克斯束之間的能量差膘螟。
像大多數(shù)其他非線(xiàn)性光學(xué)顯微鏡一樣，光束掃描方法通常用于CARS和SRS圖像采集碾局。在物鏡之前放置一對(duì)振鏡或振鏡掃描頭荆残。在本例中踪央，使用了一對(duì)振鏡（GVS 102蛉鹿，Thorlabs）。
物鏡/聚光鏡净薛，探測(cè)器和數(shù)據(jù)采集
在掃描頭后像啼，將光束導(dǎo)向物鏡以在樣品上形成一個(gè)緊密聚焦的點(diǎn)俘闯。為了建立相干拉曼散射的相位匹配條件，最好使用高數(shù)值孔徑
（NA）的水或油浸物鏡忽冻。然后沿向前方向收集光,將其重新聚焦到光電探測(cè)器上真朗。確保收集效率，建議使用油浸物鏡僧诚。在本例中遮婶，使用
的是60X 1.2 NA水浸物鏡（UPLSASP 60XW蝗碎，Olympus）。
一旦聚光器收集到光旗扑，然后將其重新聚焦到光學(xué)濾鏡之后的光電二極管上蹦骑，以阻擋調(diào)制光束。然后臀防，將來(lái)自光電二極管的信號(hào)發(fā)送到鎖
相放大器上（取決于光電二極管的配置眠菇，可能需要前置放大器/跨阻放大器）。鎖相放大器將信號(hào)與本地振蕩器混合袱衷，然后將調(diào)制頻率
的交流信號(hào)轉(zhuǎn)換為直流輸出捎废。然后將其發(fā)送到數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)以形成圖像。在此應(yīng)用中祟昭，將Hamamatsu S3994-01與自制的跨阻放大器
配對(duì)使用，以檢測(cè)濾光器之后的剩光怖侦。然后將信號(hào)發(fā)送到Moku：Lab的LIA篡悟，以進(jìn)行交流信號(hào)放大和對(duì)話(huà)。使用外部（PLL）模式對(duì)輸
入進(jìn)行了解調(diào)匾寝“嵩幔混頻器之后使用了一個(gè)7μs二階低通濾波器。然后艳悔，在10 dB增益之后急凰，將解調(diào)后的信號(hào)發(fā)送到模擬輸出。 LIA的輸出
由NI DAQ系統(tǒng)數(shù)字化猜年，圖像由家用NI虛擬儀器生成抡锈。
結(jié)果和討論
為了測(cè)試Moku：Lab的LIA性能，將一滴二甲亞砜（DMSO）夾在兩個(gè)蓋玻片之間乔外。 然后通過(guò)SRS顯微鏡對(duì)液滴的邊緣成像床三。 在掃描
頭之前，用798 nm泵浦（30 mW）和1 040 nm Stokes（1 50 mW）調(diào)諧激光器杨幼。在整個(gè)光譜范圍內(nèi)總共采集了1 00張圖像撇簿。LIA的
時(shí)間常數(shù)設(shè)置為7μs。圖4示出了液滴邊緣的X-Y輪廓差购，并且在右側(cè)繪制了Z輪廓（拉曼光譜）四瘫。 可以清楚地觀(guān)察到由C-H鍵振動(dòng)共振引
起的兩個(gè)主峰。
要訪(fǎng)問(wèn)圖像的信噪比（SNR）欲逃，請(qǐng)使用最亮的圖像（2930 cm-1附近）找蜜。 信噪比（SNR）由液滴區(qū)域中10×10框的平均強(qiáng)度超過(guò)背景
區(qū)域10×10框的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得出。觀(guān)察信SNR為1100稳析。
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