拉曼光譜的主要優(yōu)點(diǎn)之一是其自發(fā)性質(zhì)，可以對生物樣品進(jìn)行無標(biāo)簽光譜分析云挟。然而转质，自發(fā)拉曼只發(fā)生在大約1 / 108的入射光子中园欣，這嚴(yán)重限制了信號的強(qiáng)度。許多生物樣品在可見范圍內(nèi)發(fā)出熒光休蟹，這可能會壓倒拉曼信號沸枯，這進(jìn)一步加劇了這一事實(shí)日矫。
拉曼光譜成像模式的優(yōu)化方法
為了減少來自熒光對拉曼信號的影響哪轿，人們可以使用長波長激光，但是相應(yīng)的拉曼信號會有所降低翔怎。目前窃诉，大多數(shù)拉曼成像是在700到900納米之間進(jìn)行的，在這個范圍內(nèi)赤套，可以發(fā)現(xiàn)自發(fā)熒光和拉曼信號之間的妥協(xié)飘痛。即便如此，需要很長的采集時間來檢測足夠的光子敦冬，并獲得可接受的信號噪聲。在快速系統(tǒng)中唯沮，獲取足夠的光子來測量單個拉曼光譜大約需要0.5秒脖旱，這意味著通過點(diǎn)掃描獲得一幅512 × 512像素的拉曼圖像需要36小時。為了克服這一限制介蛉，人們已經(jīng)開發(fā)了幾種拉曼成像模式和技術(shù)萌庆，可分為兩種主要策略:提高成像采集速度和提高信號強(qiáng)度。
在第①種策略中币旧，對圖像采集設(shè)置進(jìn)行了修改，以提高成像采集速度吹菱，以便即使有低拉曼信號巍虫，也可以在更短的時間內(nèi)獲取圖像。這通常是通過離開點(diǎn)掃描方法鳍刷，并試圖同時獲得幾個像素來實(shí)現(xiàn)的占遥。目前已開發(fā)的主要方法是線掃描和縫掃描、寬視場輕片顯微鏡成像和多焦成像输瓜。這些方法通常達(dá)到比點(diǎn)掃描成像快20倍的采集速度瓦胎，即使它們對活細(xì)胞成像不夠快，但它們構(gòu)成了拉曼光譜許多其他應(yīng)用的合適替代品尤揣。
在第②種策略中搔啊，通過使用不同的拉曼模式來增加拉曼信號的強(qiáng)度，這反過來允許更短的捕獲時間北戏。在腦生理病理研究中负芋，與自發(fā)拉曼相比嗜愈，常用三種模式來提高信號強(qiáng)度:非線性拉曼散射技術(shù)莽龟，如受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)，以及表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)蚜点。
圖1
在拉曼散射的非線性模式中轧房，使用多個激光刺激特定的振動躍遷，從而增加信號的強(qiáng)度绍绘。簡單地說奶镶，在SRS中，樣品用自發(fā)拉曼中的“泵浦”激光照射陪拘，并結(jié)合較低頻率的“斯托克斯”激光厂镇。斯托克斯激光器頻率的選擇使兩種激光器之間的能量差(?v)與特定振動躍遷的能量差相似左刽，從而增強(qiáng)了該躍遷的發(fā)生捺信，并增加了其信號(圖1)。對于每個泵浦和斯托克斯頻率組合欠痴，可以獲得單個振動峰值的窄帶測量迄靠。通過鎖定其中一個激光器的頻率并改變另一個激光器的頻率，可以獲得寬帶或高光譜測量掌挚，因此可以掃描和檢測振動躍遷的整個范圍。信號強(qiáng)度的增加使得512 × 512像素圖像的視頻速率成像達(dá)到25fps菩咨。此外吠式，在SRS中，信號隨采樣分子的濃度線性縮放抽米，允許定量成像特占。
CARS也是一種非線性多光子技術(shù)云茸，樣品由泵浦和斯托克斯短脈沖激光器照射是目。在SRS中，這些激光經(jīng)過調(diào)諧查辩，使它們能量差與目標(biāo)分子特定振動躍遷的能量重合胖笛，在高于基態(tài)的能級上誘導(dǎo)特定相干振動。這些振動分子被第三個“探測”激光探測宜岛，通常與泵浦激光頻率相同，使它們回到基態(tài)并產(chǎn)生頻率高于探測激光的反斯托克斯信號(圖1)功舀。通過固定泵浦激光的波長和改變斯托克斯光束的頻率萍倡，可以獲得像SRS中那樣的寬帶測量。CARS實(shí)現(xiàn)了信號強(qiáng)度的1000倍提高列敲，并且由于散射光是藍(lán)移的，因此它不受自熒光的干擾戴而。與SRS一樣凑术，信號強(qiáng)度的增加允許更短的采集時間，允許高達(dá)20 fps的視頻速率成像所意。與SRS不同淮逊，CARS信號與濃度呈非線性相關(guān)，因此定量成像并不簡單扶踊。
第三種信號增強(qiáng)技術(shù)泄鹏，SERS，依賴于修改樣本來增強(qiáng)信號秧耗。在SERS中备籽，使用金和銀等金屬納米顆粒，當(dāng)受到入射光的撞擊時分井，它們的表面會產(chǎn)生強(qiáng)烈的電磁場车猬，增強(qiáng)目標(biāo)分子的拉曼信號。這一過程背后的物理現(xiàn)象尚不完全清楚尺锚，但已經(jīng)確定的是，使用SERS信號可以提高到1014-1015倍缩麸，甚至可以檢測單個分子铸磅。因?yàn)榻饘俦砻嫣峁┝嗽鰪?qiáng)，感興趣的分子必須與被檢測的金屬相互作用杭朱。盡管這限制了該技術(shù)的應(yīng)用阅仔，但它可以通過使用靶向特定細(xì)胞器或分子的納米顆粒實(shí)現(xiàn)選擇性可視化。
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