將暗場顯微鏡與高光譜成像相結(jié)合的研究方法可有效研究組織油湖、活細胞或溶液中的納米材料巍扛。超連續(xù)光源和高光譜成像濾波器，可將顯微鏡轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖庾V暗場成像系統(tǒng)乏德，涵蓋可見光和近紅外光范圍撤奸。這種高光譜暗場成像系統(tǒng)在納米材料研究中具有潛在應(yīng)用，利用暗場高光譜顯微鏡揭示透明喊括、未染色樣品（如聚合物胧瓜、晶體和活細胞）上的納米顆粒特性，無需繁瑣的樣品準(zhǔn)備郑什，對于改進基于納米等離子體的成像和疾病檢測具有重要意義府喳。
金納米顆粒的高光譜暗場特性研究：鑒別與定位
將暗場顯微鏡與高光譜成像相結(jié)合，提供了一種高效的方式來研究組織蘑拯、活細胞或溶液中的納米材料钝满。從等離子體和其他納米結(jié)構(gòu)的散射光中獲得的信息，有助于我們了解它們的成分申窘、尺寸和分布情況弯蚜。
Photon etc.公司提供兩種不同的高光譜暗場成像平臺：可調(diào)諧激光源（TLS）和IMA，前者允許在激發(fā)下進行濾波偶洋，后者提供發(fā)射濾波
TLS由兩個模塊組成：超連續(xù)譜源（寬帶源）和基于Photon等的體積布拉格光柵（VBG）技術(shù)的激光線可調(diào)諧濾波器（LLTF-帶通濾波器）熟吏。IMA由同樣基于VBG的高光譜成像濾光片（超立方體）組成。當(dāng)與配備暗場聚光鏡的研究級顯微鏡結(jié)合使用時，TLS和超立方體可以將該顯微鏡轉(zhuǎn)換為高光譜暗場設(shè)置牵寺。這些系統(tǒng)可在可見光（400-1000nm）悍引、近紅外（900-1620nm）或兩者（400-1620nm）光譜范圍內(nèi)連續(xù)調(diào)諧。這一套平臺能夠在無需繁瑣的樣品準(zhǔn)備的情況下帽氓，深入研究納米材料的性質(zhì)趣斤。
一、使用TLS獲得的結(jié)果
在Patskovsky等人[1]的這項研究中黎休，使用高光譜暗場成像研究了靶向CD44+陽性人類乳腺癌細胞的金等離子體納米顆粒（AuNPs）浓领。這套系統(tǒng)已成功用于在固定的細胞制備中執(zhí)行CD44靶向AuNPs的三維光譜定位和光譜鑒定（見圖1）。這種空間和光譜信息對于改進基于納米等離子體的成像势腮、疾病檢測和在復(fù)雜生物環(huán)境中的治療至關(guān)重要联贩。
圖1、使用100倍物鏡沿光學(xué)z軸在不同平面拍攝的暗場圖像捎拯。焦平面位于（a）玻璃基底表面（S點）或（b）人類乳腺癌細胞的頂部表面或細胞內(nèi)部（C點）[1]泪幌。
與華盛頓大學(xué)的David Ginger教授合作，使用Photon etc.公司的高光譜暗場成像儀對100納米的AuNPs進行了研究署照。從432nm到849nm以3nm的步長獲取了散射數(shù)據(jù)祸泪。圖2（a）和（b）顯示了高光譜結(jié)果和從數(shù)據(jù)中提取的典型散射光譜（c）。波長的變化有助于確定顆粒的大小建芙，空間信息有助于評估顆粒的分布没隘。
圖2、（a）從高光譜數(shù)據(jù)中提取的576nm暗場圖像禁荸；（b）放大了提取光譜的區(qū)域右蒲；（c）提取的散射光譜。
二屡限、使用IMA獲得的結(jié)果
在蒙特利爾理工學(xué)院Michel Meunier教授的研究小組的研究中品嚣，IMA被用于研究用AuNPs標(biāo)記的人類乳腺癌細胞。
Photon etc.的高通量高光譜濾波器允許快速獲取光譜分辨率高的圖像钧大。由于相機捕捉到視場內(nèi)的整個圖像翰撑，因此可以實時收集信息并跟蹤細胞和發(fā)光的納米尺度組分的動態(tài)。Photon etc.的PHySpec?軟件允許進行主成分分析（PCA）啊央，以便在樣品中識別和定位納米顆粒眶诈。
Photon etc.公司的高光譜濾光片其高通量的特性，可快速獲取光譜分辨率高的圖像瓜饥。由于相機捕捉的是視場中的整個圖像逝撬，因此可以實時收集信息并跟蹤細胞和發(fā)光納米級組件的動態(tài)。Photon etc.公司的軟件PHySpec?可進行主成分分析(PCA)乓土，以識別和定位樣品中的納米顆粒宪潮。
圖3（a）呈現(xiàn)了使用60x物鏡拍攝的溯警，標(biāo)記有60nm AuNPs的MDA-MB-23人類乳腺癌細胞的暗場圖像。在400nm到650nm的范圍內(nèi)狡相，以2nm的步長和2s的曝光時間進行成像梯轻，面積為150 x 112μm2。幾分鐘內(nèi)尽棕，獲取了一百多萬個光譜喳挑，每個光譜都覆蓋了整個可見光范圍。
細胞通常具有平坦的散射光譜滔悉，而AuNPs在約550nm處顯示出尖銳的峰值伊诵。圖3（b）展示了從乳腺癌的暗場高光譜立方體中提取的550nm圖像。經(jīng)過PCA軟件處理后回官，金納米顆粒被標(biāo)記為綠色曹宴。乳腺癌細胞的放大圖（圖3c)和包含AuNPs的區(qū)域的光譜（圖3d)證實了60nm納米顆粒的存在。
圖3歉提、（a）標(biāo)有AuNps（60nm尺寸）的人類乳腺癌細胞的暗場圖像浙炼，（b）550nm的單色圖像，經(jīng)過PCA后標(biāo)記為綠色的AuNPs唯袄，（c）乳腺癌細胞的放大圖，（d）不同區(qū)域中AuNPs的散射光譜（請參見（c）中相應(yīng)的箭頭）蜗帜。
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相關(guān)文獻：
[1] Patskovsky, S., Bergeron, E., & Meunier, M. (2013). Hyperspectral darkfield microscopy of PEGylated gold nanoparticles targeting CD44-expressing cancer cells. Journal of Biophotonics, 8(1–2), 162–167.
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